[发明专利]一种检测α-地贫和β-地贫点突变的方法在审
申请号: | 202011341324.3 | 申请日: | 2020-11-24 |
公开(公告)号: | CN112646872A | 公开(公告)日: | 2021-04-13 |
发明(设计)人: | 李仁强;王方金;罗俊峰;陈云弟 | 申请(专利权)人: | 阅尔基因技术(苏州)有限公司 |
主分类号: | C12Q1/6883 | 分类号: | C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11 |
代理公司: | 苏州市中南伟业知识产权代理事务所(普通合伙) 32257 | 代理人: | 王玉仙 |
地址: | 215000 江苏省苏州市工业园区桑*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 检测 突变 方法 | ||
1.一种检测α-地贫和β-地贫点突变的方法,其特征在于,包括如下步骤:
将采用不同荧光基团标记的异尾双链荧光探针按照探针编码方式,加入到含有待检测样本的PCR反应体系中,进行扩增以及荧光信号收集,计算不同荧光通道的荧光净增量,与突变判定阈值进行比较,判定点突变类型;
其中,所述的异尾双链荧光探针包括荧光链和淬灭链,所述的荧光链的5’端标记荧光基团,3’端标记阻止寡核苷酸延伸的基团,所述的淬灭链3’端标记荧光淬灭基团;荧光链5’端3~25bp与模板序列不互补,与模板序列不互补区域的自由能为-25~-2kcal/mol;所述荧光链3’端10~80bp与模板序列互补,互补区域的Tm值为50~70℃;所述淬灭链与荧光链5’端互补,荧光链3’端5~80bp与淬灭链不互补,形成T区域,其中,T区域的自由能为-25~-4kcal/mol,淬灭链与荧光链5’端互补区域的自由能为-30~-1kcal/mol。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,检测α-地贫点突变的荧光链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-13所示,淬灭链的核苷酸序列如SEQ ID NO.14-20所示;检测β-地贫点突变的荧光链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21-52所示,淬灭链的核苷酸序列如SEQ ID NO.54-85所示。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的荧光基团为FAM、VIC、HEX、NED、CY5、Texas Red、TAMRA中的一种;所述的荧光淬灭基团为BHQ系列、3'IBRQ、3'IBFQ中的一种。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的阻止寡核苷酸延伸的基团为磷酸基团、MGB、简臂、错配碱基中的一种。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的异尾双链荧光探针中荧光链与淬灭链比例为1:2~1:20。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的探针编码方式如下所示:
其中,管I中包含如下所示的异尾双链荧光探针:
管II中包含如下所示的异尾双链荧光探针:
管III包含如下所示的异尾双链荧光探针:
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的异尾双链荧光探针中还包括内参荧光链与内参淬灭链,核苷酸序列分别如SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.86所示。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的PCR反应体系中还包括PCR扩增引物、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、ROX荧光染料、阳性对照、阴性对照和纯水。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述的PCR扩增引物包括扩增α-地贫点突变序列的引物组合和扩增β-地贫点突变基因序列的引物组合;所述的扩增α-地贫点突变序列的引物组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示;所述的扩增β-地贫点突变基因序列的引物组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-6所示。
10.一种检测α-地贫和β-地贫点突变的试剂盒,其特征在于,包括异尾双链荧光探针、PCR扩增引物、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、ROX荧光染料、阳性对照、阴性对照和纯水;
所述的异尾双链荧光探针包括荧光链,以及与荧光链5’端完全互补的淬灭链,所述的荧光链的5’端标记荧光基团,3’端标记阻止寡核苷酸延伸的基团,所述的淬灭链3’端标记荧光淬灭基团;检测α-地贫点突变的荧光链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-13所示,淬灭链的核苷酸序列如SEQ ID NO.14-20所示;检测β-地贫点突变的荧光链的核苷酸序列如SEQID NO.21-52所示,淬灭链的核苷酸序列如SEQ ID NO.54-85所示。
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