[发明专利]一种犬促甲状腺激素检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种犬促甲状腺激素检测试剂盒，其特征在于，包括微孔板、酶标液、封闭试剂、显色试剂、样品稀释液、标准样品和终止试剂，其中，所述微孔板上预包被犬促甲状腺激素单克隆抗体Ⅰ，所述酶标液为HRP标记的犬促甲状腺激素单克隆抗体Ⅱ。

2.如权利要求1所述的犬促甲状腺激素检测试剂盒，其特征在于，所述犬促甲状腺激素单克隆抗体Ⅰ由犬促甲状腺激素重组抗原Ⅰ经免疫制备而得；所述犬促甲状腺激素单克隆抗体Ⅱ由犬促甲状腺激素重组抗原Ⅱ经免疫制备而得。

3.如权利要求2所述的犬促甲状腺激素检测试剂盒，其特征在于，所述犬促甲状腺激素单克隆抗体Ⅰ是经如下免疫方法制备而得：

S1、将200μg犬促甲状腺激素重组抗原Ⅰ与弗氏完全佐剂等量混合均匀，乳化后，向选用的第一只6周龄Balb/c雌小鼠的腹腔内注射100μl，每隔2～3周，对选用的所述第一只6周龄Balb/c雌小鼠进行加强免疫；

S2、以纯犬促甲状腺激素重组抗原Ⅰ注射小鼠腹腔和尾静脉各50μg，3d后取所述第一只6周龄Balb/c雌小鼠的脾细胞，无菌条件下，将所述第一只6周龄Balb/c雌小鼠的脾细胞和SP2/0细胞进行融合，使融合后的细胞在HAT培养基中生长，置于有饲养层细胞的培养板中；

S3、通过阳性克隆筛选和克隆化培养得到杂交瘤细胞株Ⅰ，将所述杂交瘤细胞株Ⅰ接种于预先用诱导剂处理的第二只6周龄Balb/c雌小鼠，收取腹水，纯化后，用ELISA法测定抗体效价，得到犬促甲状腺激素单克隆抗体I。

4.如权利要求2所述的犬促甲状腺激素检测试剂盒，其特征在于，所述犬促甲状腺激素单克隆抗体Ⅱ是经如下免疫方法制备而得：

S1、将200μg犬促甲状腺激素重组抗原Ⅱ与弗氏完全佐剂等量混合均匀，乳化后，向选用的第三只6周龄Balb/c雌小鼠的腹腔内注射100μl，每隔2～3周，对选用的所述第三只6周龄Balb/c雌小鼠进行加强免疫；

S2、以纯犬促甲状腺激素重组抗原Ⅱ注射小鼠腹腔和尾静脉各50μg，3d后取所述第三只6周龄Balb/c雌小鼠的脾细胞，无菌条件下，将所述第三只6周龄Balb/c雌小鼠的脾细胞和SP2/0细胞进行融合，使融合后的细胞在HAT培养基中生长，置于有饲养层细胞的培养板中；

S3、通过阳性克隆筛选和克隆化培养得到杂交瘤细胞株Ⅱ，将所述杂交瘤细胞株Ⅱ接种于预先用诱导剂处理的第四只6周龄Balb/c雌小鼠，收取腹水，纯化后，用ELISA法测定抗体效价，得到犬促甲状腺激素单克隆抗体Ⅱ。

5.如权利要求1所述的犬促甲状腺激素检测试剂盒，其特征在于，所述封闭试剂为含有0.01％Proclin200的5％的牛奶，所述样品稀释液为0.01mol/L的PBS缓冲溶液，所述显色试剂为ABTS，所述终止试剂为1.25％的NaF溶液，所述微孔板为NUNC板，所述标准样品中促甲状腺激素的含量为0.2ug/ml。

6.如权利要求1所述的犬促甲状腺激素检测试剂盒，其特征在于，在所述微孔板上包被犬促甲状腺激素单克隆抗体Ⅰ的步骤如下：

S1、应用碳酸盐缓冲溶液对犬促甲状腺激素单克隆抗体Ⅰ进行稀释；

S2、将稀释后的犬促甲状腺激素单克隆抗体Ⅰ按100ul/孔的加入量加入所述微孔板内，4℃下静置包被，包被后将多余的犬促甲状腺激素单克隆抗体Ⅰ吸去；

S3、应用所述封闭试剂对包被后的所述微孔板进行封闭，弃去多余的所述封闭试剂，扣干；

S4、将所述微孔板置于室温真空环境下干燥，得到预包被犬促甲状腺激素单克隆抗体Ⅰ的微孔板，真空密封环境下保存，备用。

7.如权利要求6所述的犬促甲状腺激素检测试剂盒，其特征在于，步骤S1中，稀释后所述犬促甲状腺激素单克隆抗体Ⅰ的浓度为0.1mg/ml～0.25mg/ml；步骤S2中，所述静置包被的时间为15h～23h；步骤S3中，所述封闭的时间为30min。