[发明专利]用于构建TPH2基因突变的抑郁症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统

说明书

本发明公开了用于构建TPH2基因突变的抑郁症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统。该系统包含Cas9表达载体和针对猪TPH2基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示，所述的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.33所示的gRNA；且该表达载体的载体骨架为pKG‑U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体有了显著的提高。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及靶点gRNA和CRISPR/Cas9系统在构建TPH2基因敲除的抑郁症克隆猪核供体细胞中的应用。

背景技术

抑郁症又称抑郁障碍，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的主要类型。临床可见心境低落与其处境不相称，情绪的消沉可以从闷闷不乐到悲痛欲绝，自卑抑郁，甚至悲观厌世，可有自杀企图或行为；甚至发生木僵；部分病例有明显的焦虑和运动性激越；严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状。每次发作持续至少2周以上、长者甚或数年，多数病例有反复发作的倾向，每次发作大多数可以缓解，部分可有残留症状或转为慢性。

世界卫生组织数据显示，截至目前，全球抑郁症患病人群累计超过3.5亿人，中国是抑郁症疾病负担较为严重的国家之一，约有5400多万人患有抑郁症。但中国青年报有关报道显示，中国约八成抑郁症患者没有被“发现”，九成没有得到规范专业治疗。抑郁症目前主要以抗抑郁药物治疗为主，辅以心理治疗或是物理治疗。由于近年抗抑郁药的发展，不同药物间有相互作用问题，规范化的治疗流程尤为重要。因此，开发出合适的动物模型以探讨既有药物的配伍和开发新的药物就尤为重要。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，且猪体型大小和生理功能与人类近似，是理想的人类疾病模型动物。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因敲入到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑手段，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。如在小鼠模型制作中采用的受精卵显微注射基因编辑材料后再进行胚胎移植的方法，因其直接获得纯合突变后代的概率非常低(低于5％)，需要进行后代的杂交选育，这不太适用于妊娠期较长的大动物(如猪)模型制作。

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)又名血清素,是哺乳动物体内一类重要的抑制性神经递质,广泛存在于哺乳动物组织中,特别在大脑皮层及神经突触内含量很高,对于情绪、认知等大脑功能有重要作用,被广泛认为是抑郁症发病的关键因素,且是调节抗抑郁药物疗效的重要介导者。中枢内的5-羟色胺是脑源性的，其前体是色氨酸，色氨酸经羟化和脱羧两步酶促反应生成5-羟色胺，其中色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)是5-羟色胺合成的限速酶。TPH分为TPH1及TPH2两种类型，TPH2对中枢5-羟色胺的合成具有重要作用，是与5-羟色胺功能紊乱相关的精神疾病遗传学研究中的一个重要候选基因。已有研究发现TPH2基因与情感性精神障碍、抑郁症、自杀行为、精神分裂症和物质依赖性有关。因此，本发明基于TPH2基因突变开发了抑郁症克隆猪核供体细胞，后期再通过细胞核移植动物克隆技术培育出活体猪模型，可用于进行抑郁症相关药物筛选、疾病病理等研究，为进一步的临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类抑郁症提供有力的实验手段。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于猪TPH2基因编辑的CRISPR/Cas9系统。

本发明的另一目的是提供一种猪TPH2基因突变的猪重组细胞。

本发明的又一目的是提供针对猪TPH2基因的gRNA。

本发明的目的通过以下技术方案实现：