[发明专利]一种转化酶及其在产S-雌马酚中的应用

权利要求书

1.一种转化酶C1-2079在催化大豆苷元生成二氢大豆苷元中的应用，其特征在于所述应用为：以转化酶C1-2079为催化剂，以大豆苷元为底物，以NADPH、NADH为辅酶，加入亚硫酸氢钠、二硫苏糖醇和苯甲基磺酰氟，以pH7.0的0.1M磷酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃厌氧条件下反应2-4h后，得到含有二氢大豆苷元的转化液；所述转化酶C1-2079的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述反应体系中，转化酶C1-2079加入终浓度为40μg/ml，大豆苷元加入终浓度为20μg/ml，NADPH和NADH加入终浓度均为500μg/ml，亚硫酸氢钠加入终浓度为0.5mg/ml，二硫苏糖醇加入终浓度均为0.3mg/ml，苯甲基磺酰氟加入终浓度均为0.2mg/ml。

2.一种转化酶C1-2079在催化二氢大豆苷元生成大豆苷元中的应用，其特征在于所述应用的方法为：以转化酶C1-2079为催化剂，以二氢大豆苷元为底物，以pH 6.5的0.1M柠檬酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃条件下反应2-4h后，得到含有大豆苷元的转化液；所述转化酶C1-2079的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述反应体系中，转化酶C1-2079加入终浓度为40μg/ml，二氢大豆苷元加入终浓度为20μg/ml。

3.一种转化酶C1-2079在制备S-雌马酚中的应用，其特征在于所述应用为：以含转化酶C1-2079编码基因、二氢大豆苷元外消旋酶DDRC编码基因、二氢大豆苷元还原酶DHDR编码基因、四氢大豆苷元还原酶THDR编码基因的工程菌发酵培养液作为催化剂，以大豆苷元为底物，在37℃条件下静置发酵6-8h，获得含S-雌马酚的反应液，分离纯化，获得S-雌马酚，所述转化酶C1-2079的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述大豆苷元加入终浓度为40μg/ml；所述催化剂中菌体OD₆₀₀为1.8。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将包含转化酶C1-2079编码基因、二氢大豆苷元外消旋酶DDRC编码基因、二氢大豆苷元还原酶DHDR编码基因、四氢大豆苷元还原酶THDR编码基因的工程菌接种至含有100μg/ml氨苄抗性和100μg/ml链霉素抗性的LB培养基中，37℃、180rpm孵育；当细菌OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，在16℃、120rpm条件下诱导表达16h，获得发酵培养液。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述工程菌按如下方法构建：(1)转化酶C1-2079编码基因、载体PETDute-1-L-DZNR-DDRC分别经NotI和AvrII限制性内切酶酶切后连接，构建质粒PETDute-1-C1-2079-DDRC；(2)将PETDute-1-C1-2079-DDRC质粒加入到含0.1M氯化钙的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞液中，冰浴30min，然后42℃热冲击90s，再冰浴2min，加入4倍体积的LB培养基，37℃，180rpm孵育1h；收集孵育后的菌泥涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB平板中，37℃培养12-16h；(3)挑取长出来的单菌落，在含有100μg/ml氨苄抗性的LB培养基中，37℃、180rpm培养2-4h至细菌OD₆₀₀为0.1；取菌液，在5000rpm条件下离心获得菌泥，将所获得的菌泥用无菌0.1M的CaCl₂溶液洗涤三次，加入预冷的0.1M无菌CaCl₂溶液悬浮菌体，然后在冰浴条件下孵育2-4h；(4)将PCDFDute-L-DHDR-THDR质粒加入到步骤(3)冰浴后的菌液中，将步骤(2)中氨苄抗性改为100μg/ml氨苄和100μg/ml链霉素抗性，其他操作同步骤(2)，构建含PETDute-1-C1-2079-DDRC和PCDFDute-L-DHDR-THDR的重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。