[发明专利]固定化经修饰的7β-羟基甾体脱氢酶及其应用

说明书

本发明提供了一种利用固定化酶催化剂及其合成熊去氧胆酸的方法。固定化酶包含7β‑羟基甾体脱氢酶或其突变体，葡萄糖脱氢酶以及氨基固定化树脂。固定化酶相比自由酶而言提高了产品熊去氧胆酸的纯度，降低了后续反应的纯化成本。

技术领域

本发明涉及酶工程及固定化酶领域。具体而言，本发明涉及固定化经修饰的7β-羟基甾体脱氢酶催化合成7-酮-石胆酸的应用。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，为甾体化合物，化学名为3β,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，是一种胆酸类似物，有利胆作用。在临床上用于治疗胆结石、胆汁淤积性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障碍、胆囊炎、胆道炎和胆汁性消化不良、胆汁返流性胃炎、眼部疾病等。

UDCA可以从人工养殖的熊的胆中获得，但是收率低，来源有限，而且有动物保护问题。因此，人工合成UDCA具有重要意义。UDCA的合成方法主要有全化学合成和化学-酶促合成的方法，起始原料为动物来源的胆酸(CA)或去氧胆酸(如CDCA)。

UDCA的经典化学合成方法包括如式I所示的步骤:

上述反应需要使用金属钠或者Pd/C催化氢化，选择性低，工业化放大生产不容易控制且不安全。现有技术已经有尝试用7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)催化上述反应，并且反应选择性高，不会形成副产物。

但是，现有技术用到的自由酶会使产品带入残留宿主蛋白和核酸，影响产品的纯度，同时由于酶不能回收利用，造成浪费。因此，本领域需要提供一种能够合成高纯度产品以及能回收套用的酶催化剂。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种固定化酶催化剂，以及使用该催化剂催化合成熊去氧胆酸的方法。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种固定化酶催化剂，该固定化酶催化剂包括活化的树脂以及共价结合在所述活化的树脂上的酶；所述酶单独为7β-羟基甾体脱氢酶，或者7β-羟基甾体脱氢酶和辅酶再生酶；

进一步地，所述活化的树脂为戊二醛活化的带有氨基的树脂。

进一步地，戊二醛溶液的浓度为1％-2％。

进一步地，7β-羟基甾体脱氢酶和辅酶再生酶被同时共价固定到一种树脂上。

进一步地，所述辅酶再生酶选自：醇脱氢酶、甲酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶中的一种或多种。

进一步地，所述7β-羟基甾体脱氢酶来源于Clostridium sp.Marseille，所述葡萄糖脱氢酶来源于Bacillus subtilis。

本发明还发现，可以对7β-羟基甾体脱氢酶进行定点突变，突变后的7β-羟基甾体脱氢酶在树脂上的负载量以及负载牢固度得到大幅提升；

进一步地，含突变体的固定化酶催化剂反应30次后仍然保持64％以上的反应活性。

进一步地，含突变体的固定化酶催化剂反应30次后仍然保持75％以上的反应活性。

进一步地，含突变体的固定化酶催化剂反应30次后仍然保持99％以上的反应活性。

进一步地，所述突变发生在7β-羟基甾体脱氢酶第54和/或第216个氨基酸位置；

进一步地，所述突变体为S54K、A216K或S54K/A216K，上述突变后的7β-羟基甾体脱氢酶分别具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的氨基酸序列。

进一步地，酶蛋白与树脂质量比为1:15到1:8。