[发明专利]一种抗酸胁迫能力强的大肠杆菌工程菌及应用

说明书

本发明公开了一种抗酸胁迫能力强的大肠杆菌工程菌及应用，属于微生物工程技术领域。本发明以编码dTDP‑葡萄糖焦磷酸化酶2RffH和/或编码dTDP‑葡萄糖4,6‑脱水酶RffG的基因为目的基因，以大肠杆菌为表达宿主，成功构建了一种可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的大肠杆菌工程菌；此大肠杆菌工程菌的D‑乳酸胁迫抗性得到了显著提高，较野生菌株最高分别提高了28.9倍和4509.6倍。

技术领域

本发明涉及一种抗酸胁迫能力强的大肠杆菌工程菌及应用，属于微生物工程技术领域。

背景技术

大肠杆菌是原核生物中一种重要的宿主菌。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。目前，已有多种高价值的有机酸生物发酵方法成功应用，其中也有人尝试以大肠杆菌为宿主来表达，但是常常存在酸胁迫的问题。

乳酸的学名为α-羟基丙酸，分子式为C₂H₅OCOOH，是一种天然存在的有机酸。D-乳酸主要应用于聚乳酸材料的加工制造以及手性药物和农药中间体的合成。高光学纯度D-乳酸(97％以上)作为一个手性中心是多种手性物质的前体，是重要的手性中间体与有机合成原料，广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成。同时其最主要的应用是作为生物塑料聚乳酸的原料。在大肠杆菌中，D-乳酸通过丙酮酸代谢途径产生，野生型大肠杆菌菌株就具有固有的乳酸生成途径，可通过乳酸脱氢酶(LdhA)将丙酮酸转化为乳酸，不需要额外引入异源LdhA来产生乳酸。但是由于大肠杆菌系统存在酸胁迫的问题，而制约着乳酸的产量的提高。

对于酸胁迫，为维持大肠杆菌发酵生产目的蛋白的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在大肠杆菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(碳酸钙)来控制发酵环境的pH值。然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

目前，提高大肠杆菌的乳酸、乙酸等酸胁迫抗性的方法则主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点，且诱变后的菌种容易退化；(2)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高大肠杆菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径，但是，此方法存在成本高、成功率低的问题。

因此，急需找到一种遗传稳定性好、抗酸效果显著、成本低、并且成功率高及操作简单的可提高大肠杆菌酸胁迫性的方法。

发明内容

为了得到一种遗传稳定性好、抗酸效果显著、成本低、并且成功率高及操作简单的可提高大肠杆菌酸胁迫性的方法，本发明提供了一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌包含连接有目的基因的表达载体；所述目的基因为编码dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2的基因rffH，或编码dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶的基因rffG。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌E.coli K12 MG1655。

在本发明的一种实施方式中，所述dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2来源于大肠杆菌E.coli K12 MG1655。

在本发明的一种实施方式中，所述dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶来源于大肠杆菌E.coli K12 MG1655。

在本发明的一种实施方式中，所述dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2RffH的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶RffG的氨基酸序列如SEQID NO.10所示。