[发明专利]一种新型冠状病毒SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法

权利要求书

1.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法，其特征在于：

包括如下步骤：

(1)构建SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶表达质粒；

(2)将SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶表达质粒转化；

(3)诱导培养表达SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶，操作包括：取菌液到含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液体培养基中，在摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液体培养基中，在摇床上培养直至OD₆₀₀为0.6-0.8之间；加入IPTG，18℃，200rpm，诱导培养16～18h；

(4)纯化SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶，操作包括：过夜诱导后把菌液离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g，以重悬缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在含有100mM Tris HClpH7.5，300mM NaCl，2mM DTT，10mM imidazole的重悬缓冲液中；高压破碎后离心，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱进行蛋白纯化，镍柱使用前用50倍柱体积含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，10mM imidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mM、50mM、300mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；将含有PLpro的洗脱液用阴离子交换柱进行进一步的纯化，阴离子交换柱的型号为：GE Healthcare HiTrapTM Q HP，阴离子交换柱的buffer为：100mM Tris HClpH7.0。

2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法，其特征在于：

所述步骤(3)的详细过程是：

取100μl菌液到100mL含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000mL含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至OD₆₀₀为0.6-0.8之间。加入IPTG，使终浓度为0.5mM，18℃，200rpm，诱导培养16～18h。

3.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法，其特征在于：

所述步骤(4)的详细过程是：

过夜诱导后以6000rpm的转速把菌液离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g，以重悬缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，2mMDTT，10mM imidazole的重悬缓冲液中；高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱(1～2ml)进行蛋白纯化，镍柱使用前用50倍柱体积含有100mM TrisHCl pH7.5，300mM NaCl，10mM imidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mM、50mM、300mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；将含有PLpro含300mM咪唑的洗脱液用阴离子交换柱进行进一步的纯化，阴离子交换柱的型号为：GE Healthcare HiTrapTM Q HP，阴离子交换柱的buffer为：100mM Tris HCl pH7.0，纯化的产物储存备用。

4.根据权利要求1-3任一所述的一种新型冠状病毒SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法，其特征在于：

所述步骤(1)是：将编码SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶的基因克隆到pET-28a载体中，以构建表达质粒，制得PLpro质粒冻干粉。

5.根据权利要求1-3任一所述的一种新型冠状病毒SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法，其特征在于：

所述步骤(2)的详细过程是：将5μg PLpro质粒冻干粉在12000rpm离心5min,使粉末聚集在底部，加入30μl去离子水，振荡溶解，12000rpm离心10min。将上清液取2μl转化到Escherichia coli BL21 Rosetta(DE3)感受态菌株中,冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入500μl的LB液体培养基，37℃摇床，150rpm，培养1h，取30μl培养液涂布到含有50μg/ml Kan⁺抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养过夜；挑选出单一菌落，加入到含有50μg/ml Kan⁺抗生素的液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养8小时。