[发明专利]一种环己酮单加氧酶及其应用

说明书

本发明公开了一种环己酮单加氧酶及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的环己酮单加氧酶来源于嗜甲基拟无枝酸菌(Amycolatopsismethanolica)，可作为催化剂用于硫醚的高效合成。能够给以环酮、线性酮等硫醚为底物，能耐受高浓度底物、催化活性高、立体选择性强、适用的反应条件温和、对环境友好，具有很好的应用开发前景。

技术领域

本发明涉及一种环己酮单加氧酶及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

环己酮单加氧酶(CHMO)是一种FAD和NADPH依赖型Baeyer-Villiger单加氧酶，在众多BVMO中CHMO的相关研究最为广泛。环己酮单加氧酶除了催化酮类底物在羰基碳原子邻近插入一个氧原子生成相应的酯或内酯，还能够催化包括氮、硼、硒、磷和硫等杂原子的氧化以及环氧化反应。这类酶在立体选择性催化氧化硫醚不对称氧化上得到了很好的应用。

光学活性亚砜作为一种重要的手性化合物，在不对称合成中的应用日渐增多。手性亚砜具有广泛而重要的应用价值，它的用途大致可以分为三类手性辅助试剂和手性中间体，手性配体和手性催化剂以及手性药物。

苯甲硫醚体积相对较小，一些野生型CHMO对这种底物本身就有很强的活性和立体选择性。例如，CHMO_Tm在转化这种底物时主要生成R构型产物(ee＝97％)，CHMO_Acinet和FDH(甲酸脱氢酶)共表达时，显著提高了细胞对NADPH的再生能力，获得高立体选择性的S构型亚砜产物(ee＝99％)，可以用于脱硫过程中使生成和。Holland等人发现具有二苯并噻吩单加氧酶可以用于催化硫醚不对称氧化，生成相应的亚砜和砜，产物主要为R构型(《Biotransformation of sulfides by Rhodocoeccuserythropolis》，公开于2003年)。但是，除了催化氧化蛋氨酸及衍生物得到产物的光学纯度在以上，对其他硫醚氧化所得产物的ee值都不高。用产环己酮单加氧酶的菌株作为催化剂催化氧化硫醚时，其立体选择性比其胞内分离得到的环己酮单加氧酶要低。对于底物苯基烷基硫醚而言，生成的产物为构型而当苯环的对位有取代基时，产物的构型就变为了S构型，生成亚砜的ee值最高也只有中等水平。

ε-己内酯(ε-CL)是一种用途广泛的化学中间体，主要用于制备在医药、合成革、汽车涂料、鞋底料以及胶黏剂等领域具有广泛用途的高性能聚合物材料聚己内酯(PCL)。此外还可用作手术缝合线、生物降解塑料袋等。目前，ε-己内酯的合成工艺主要有环己酮和非环己酮两条工艺路线，其中采用环己酮合成ε-己内酯是国内外普遍采用的工艺路线。根据所用氧化剂的不同，它又可分为过氧酸氧化法、双氧水氧化法和氧气/空气氧化法等。在ε-己内酯的众多制备方法中，生物氧化法绿色氧化环己酮制备ε-己内酯越来越受到人们的关注。

采用生物酶氧化环已酮合成ε-己内酯，其主要困难之一，是用酶催化反应时，需要昂贵的辅酶循环系统，制约了该法的工业发展。相对来说，此类方法目前研究得还比较少。如果用微生物细胞为催化剂则可能存在以下不足：(1)细胞内酶系复杂，可能使产物降解；(2)、底物、产物扩散限制严重，底物要通过细胞壁，进入胞内反应，产物要通过细胞壁，离开细胞，大大降低了细胞催化反应速度。一般而言，与游离状态时相比，酶在细胞内的反应速度至少降低5倍。(3)、氧传递限制，细胞要用氧，反应也要用氧，氧负荷显著增加，加剧了氧传递限制；(4)、底物浓度低，因为细胞较酶更敏感，底物、产物可能对细胞抑制，这就要求反应液中底物、产物浓度必须较低(例如底物、产物浓度小于lg/L)，而且与离体酶相比，细胞催化时无菌条件要求高，使成本显著增加。另外，采用生物氧化法反应条件温和，但是技术成本高、稳定性差、效率低，而且使用的某些菌株是第二类病原体，具有较高的环境风险。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对已经报道的环己酮单加氧酶的对底物硫醚的低催化活性，热稳定性差等问题，提供了一种环己酮单加氧酶，其具有良好的可溶性，对硫醚表现出高立体选择性，并对环己酮和苯甲硫醚具有高的催化活性。