[发明专利]抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，对抗生素耐药基因位点进行荧光定量PCR检测，通过检测反应体系中溶解过程释放的荧光信号曲线，再根据结果中与隐性菌株对比所显示的循环阈值Ct值，判定样本中是否含有该耐药基因；所述抗生素为碳青霉烯类抗生素、喹诺酮类抗生素或氨基糖苷类抗生素。

2.根据权利要求1所述的抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、首先从NCBI数据库筛选并下载与对应种类抗生素耐药相关的主要基因序列，并根据主要基因突变位点上下游，通过比对序列选择保守区域设计引物；当抗生素为碳青霉烯类抗生素时，主要基因是DIM、IMP、KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、SIM、VIM基因；当抗生素为喹诺酮类抗生素时，主要基因是qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6’)-Ib和aac(6’)-Ib-cr；当抗生素为氨基糖苷类抗生素时，主要基因是aac(3)-I、aac(3)-II、aac(6’)-Ib、aac(6’)-II、ant(3”)-I、ant(2”)-I和aph(3’)-VIa；

S2、样本中细菌基因组DNA的提取，采用裂解液与样本以1：1的体积比混合，沸水中水浴10min，放置于4℃冰箱30min，期间每隔10min摇晃一下离心管，离心后取上清液备用；

S3、对相关的主要基因进行qPCR和溶解曲线扩增；

S4、根据qPCR反应结果中的每个基因的Ct值判定样品中是否含有该耐药基因。

3.根据权利要求2所述的抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，S1中，当抗生素为碳青霉烯类抗生素时，PCR引物对应的序列分别如下：

KPC-F的序列为SEQ ID NO.1；

KPC-R的序列为SEQ ID NO.2；

NDM1-F的序列为SEQ ID NO.3；

NDM1-R的序列为SEQ ID NO.4；

OXA23-F的序列为SEQ ID NO.5；

OXA23-R的序列为SEQ ID NO.6；

OXA48-F的序列为SEQ ID NO.7；

OXA48-R的序列为SEQ ID NO.8；

OXA51-F的序列为SEQ ID NO.9；

OXA51-R的序列为SEQ ID NO.10；

IMP-F的序列为SEQ ID NO.11；

IMP-R的序列为SEQ ID NO.12；

VIM-F的序列为SEQ ID NO.13；

VIM-R的序列为SEQ ID NO.14；

SIM-F的序列为SEQ ID NO.15；

SIM-R的序列为SEQ ID NO.16；

DIM-F的序列为SEQ ID NO.17；

DIM-R的序列为SEQ ID NO.18；

当抗生素为喹诺酮类抗生素时，PCR引物对应的序列分别如下：

qnrA-F的序列为SEQ ID NO.19；

qnrA-R的序列为SEQ ID NO.20；

qnrB-F的序列为SEQ ID NO.21；

qnrB-R的序列为SEQ ID NO.22；

qnrC-F的序列为SEQ ID NO.23；

qnrC-R的序列为SEQ ID NO.24；

qnrD-F的序列为SEQ ID NO.25；

qnrD-R的序列为SEQ ID NO.26；

qnrS-F的序列为SEQ ID NO.27；

qnrS-R的序列为SEQ ID NO.28；

qepA-F的序列为SEQ ID NO.29；

qepA-R的序列为SEQ ID NO.30；

aac(6’)-Ib-cr-F的序列为SEQ ID NO.31；

aac(6’)-Ib-R的序列为SEQ ID NO.32；

aac(6’)-Ib-cr-F的序列为SEQ ID NO.33；

aac(6’)-Ib-cr-R的序列为SEQ ID NO.34；

当抗生素为氨基糖苷类抗生素时，PCR引物对应的序列分别如下：

aac(3)-I-F的序列为SEQ ID NO.35；

aac(3)-I-R的序列为SEQ ID NO.36；

aac(3)-II-F的序列为SEQ ID NO.37；

aac(3)-II-R的序列为SEQ ID NO.38；

aac(6’)-Ib-F的序列为SEQ ID NO.39；

aac(6’)-Ib-R的序列为SEQ ID NO.40；

aac(6’)-II-F的序列为SEQ ID NO.41；

aac(6’)-II-R的序列为SEQ ID NO.42；

ant(3”)-I-F的序列为SEQ ID NO.43；

ant(3”)-I-R的序列为SEQ ID NO.44；

ant(2”)-I-F的序列为SEQ ID NO.45；

ant(2”)-I-R的序列为SEQ ID NO.46；

aph(3’)-VIa-F的序列为SEQ ID NO.47；

aph(3’)-VIa-R的序列为SEQ ID NO.48。