[发明专利]抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法在审

专利信息
申请号: 202011353696.8 申请日: 2020-11-27
公开(公告)号: CN112458154A 公开(公告)日: 2021-03-09
发明(设计)人: 龚正华;盛才敏;夏震遥;牛群;唐加林;唐敏 申请(专利权)人: 深圳市研元生物科技有限公司
主分类号: C12Q1/6851 分类号: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12N15/11
代理公司: 深圳市深联知识产权代理事务所(普通合伙) 44357 代理人: 黄立强
地址: 518101 广东省深圳市宝安区航城街道*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 抗生素 耐药 基因 荧光 定量 pcr 检测 方法
【权利要求书】:

1.一种抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法,其特征在于,对抗生素耐药基因位点进行荧光定量PCR检测,通过检测反应体系中溶解过程释放的荧光信号曲线,再根据结果中与隐性菌株对比所显示的循环阈值Ct值,判定样本中是否含有该耐药基因;所述抗生素为碳青霉烯类抗生素、喹诺酮类抗生素或氨基糖苷类抗生素。

2.根据权利要求1所述的抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法,其特征在于,包括如下步骤:

S1、首先从NCBI数据库筛选并下载与对应种类抗生素耐药相关的主要基因序列,并根据主要基因突变位点上下游,通过比对序列选择保守区域设计引物;当抗生素为碳青霉烯类抗生素时,主要基因是DIM、IMP、KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、SIM、VIM基因;当抗生素为喹诺酮类抗生素时,主要基因是qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6’)-Ib和aac(6’)-Ib-cr;当抗生素为氨基糖苷类抗生素时,主要基因是aac(3)-I、aac(3)-II、aac(6’)-Ib、aac(6’)-II、ant(3”)-I、ant(2”)-I和aph(3’)-VIa;

S2、样本中细菌基因组DNA的提取,采用裂解液与样本以1:1的体积比混合,沸水中水浴10min,放置于4℃冰箱30min,期间每隔10min摇晃一下离心管,离心后取上清液备用;

S3、对相关的主要基因进行qPCR和溶解曲线扩增;

S4、根据qPCR反应结果中的每个基因的Ct值判定样品中是否含有该耐药基因。

3.根据权利要求2所述的抗生素耐药基因的荧光定量PCR检测方法,其特征在于,S1中,当抗生素为碳青霉烯类抗生素时,PCR引物对应的序列分别如下:

KPC-F的序列为SEQ ID NO.1;

KPC-R的序列为SEQ ID NO.2;

NDM1-F的序列为SEQ ID NO.3;

NDM1-R的序列为SEQ ID NO.4;

OXA23-F的序列为SEQ ID NO.5;

OXA23-R的序列为SEQ ID NO.6;

OXA48-F的序列为SEQ ID NO.7;

OXA48-R的序列为SEQ ID NO.8;

OXA51-F的序列为SEQ ID NO.9;

OXA51-R的序列为SEQ ID NO.10;

IMP-F的序列为SEQ ID NO.11;

IMP-R的序列为SEQ ID NO.12;

VIM-F的序列为SEQ ID NO.13;

VIM-R的序列为SEQ ID NO.14;

SIM-F的序列为SEQ ID NO.15;

SIM-R的序列为SEQ ID NO.16;

DIM-F的序列为SEQ ID NO.17;

DIM-R的序列为SEQ ID NO.18;

当抗生素为喹诺酮类抗生素时,PCR引物对应的序列分别如下:

qnrA-F的序列为SEQ ID NO.19;

qnrA-R的序列为SEQ ID NO.20;

qnrB-F的序列为SEQ ID NO.21;

qnrB-R的序列为SEQ ID NO.22;

qnrC-F的序列为SEQ ID NO.23;

qnrC-R的序列为SEQ ID NO.24;

qnrD-F的序列为SEQ ID NO.25;

qnrD-R的序列为SEQ ID NO.26;

qnrS-F的序列为SEQ ID NO.27;

qnrS-R的序列为SEQ ID NO.28;

qepA-F的序列为SEQ ID NO.29;

qepA-R的序列为SEQ ID NO.30;

aac(6’)-Ib-cr-F的序列为SEQ ID NO.31;

aac(6’)-Ib-R的序列为SEQ ID NO.32;

aac(6’)-Ib-cr-F的序列为SEQ ID NO.33;

aac(6’)-Ib-cr-R的序列为SEQ ID NO.34;

当抗生素为氨基糖苷类抗生素时,PCR引物对应的序列分别如下:

aac(3)-I-F的序列为SEQ ID NO.35;

aac(3)-I-R的序列为SEQ ID NO.36;

aac(3)-II-F的序列为SEQ ID NO.37;

aac(3)-II-R的序列为SEQ ID NO.38;

aac(6’)-Ib-F的序列为SEQ ID NO.39;

aac(6’)-Ib-R的序列为SEQ ID NO.40;

aac(6’)-II-F的序列为SEQ ID NO.41;

aac(6’)-II-R的序列为SEQ ID NO.42;

ant(3”)-I-F的序列为SEQ ID NO.43;

ant(3”)-I-R的序列为SEQ ID NO.44;

ant(2”)-I-F的序列为SEQ ID NO.45;

ant(2”)-I-R的序列为SEQ ID NO.46;

aph(3’)-VIa-F的序列为SEQ ID NO.47;

aph(3’)-VIa-R的序列为SEQ ID NO.48。

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