[发明专利]一种基于潮霉素筛选的大青杨转基因体系建立的方法

说明书

本发明提供了一种基于潮霉素筛选的大青杨转基因体系建立的方法，属于植物育种技术领域。基于潮霉素筛选的大青杨转基因体系建立的方法，将含报告基因的重组载体导入农杆菌中培养，用农杆菌菌液侵染大青杨外植体后共培养，脱菌后，将大青杨外植体接种至含潮霉素的叶片不定芽分化培养基上进行筛选培养得到抗性芽，将抗性芽进行生根培养，获得大青杨转基因再生植株。本发明采用潮霉素作为筛选标记能有效降低转基因再生植株的假阳性率，同时本发明还具体限定了潮霉素筛选工作浓度、根癌农杆菌菌株、农杆菌菌液OD值、侵染时间、共培养时间以及温度等能大大提高抗性芽诱导率的因素，为大青杨育种提供稳定、可靠的材料。

技术领域

本发明属于植物育种技术领域，具体涉及一种基于潮霉素筛选的大青杨转基因体系建立的方法。

背景技术

大青杨(Populus ussuriensis Kom.)是东北林区主要的乡土树种，耐寒、速生，是山地营造速生用材林的主要树种之一，也是我国东北地区青杨派树种中分布最广、利用价值最大的树种。干形通直，木材洁白，是造纸及胶合板材极好的原料。随着天然林的不断采伐，人们开始营造大青杨的人工林。林地条件往往需要抗逆适应性强的大青杨新品种。但常规的育种周期长、工序复杂，且受外界环境的影响大，不能满足短期内有目的定向培育杨树新品种的需要。而基因工程育种可有目的定向培育杨树新品种，且极大程度上缩短育种周期。因此，大青杨转基因体系的建立尤为重要。

目前，大青杨转基因体系已有研究，在构建大青杨转基因体系的过程中，常采用卡那霉素进行筛选，但该筛选方法的筛选效果不佳，大约有一半的概率为假阳性，给大青杨转基因植物的育种带来阻碍。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于潮霉素筛选的大青杨转基因体系建立的方法，降低假阳性筛选结果，为大青杨转基因植物的构建奠定基础。

本发明提供了一种基于潮霉素筛选的大青杨转基因体系建立的方法，包括以下步骤：

1)将含目标基因的重组载体导入农杆菌中培养，得到农杆菌菌液；

2)用所述农杆菌菌液侵染大青杨外植体后共培养，脱菌后，得到侵染后的大青杨外植体；

3)将所述侵染后的大青杨外植体接种至含潮霉素的叶片不定芽分化培养基上进行筛选培养，得到不定芽；

4)将所述不定芽进行生根培养，获得大青杨转基因再生植株。

优选的，步骤3)中所述叶片不定芽分化培养基中潮霉素的浓度为2.5～3.2mg/L。

优选的，步骤1)中含目标基因的重组载体的基础骨架载体为pCAMBIA1302。

优选的，步骤1)中所述农杆菌为根癌农杆菌；

所述根癌农杆菌的菌株包括EHA101、EHA105或LBA4404。

优选的，步骤1)中所述农杆菌菌液的OD值为0.5～0.8；

所述农杆菌菌液的侵染时间为25～50min。

优选的，步骤2)中所述农杆菌菌液与大青杨外植体共培养的时间为2～3.5d。

优选的，步骤2)中所述农杆菌菌液与大青杨外植体共培养的温度为20～27℃。

优选的，步骤2)中所述大青杨外植体包括茎段和叶片。

优选的，步骤2)中所述叶片不定芽分化培养基为含0.5～2mg/L 6-BA、0.2mg/LNAA和0～0.1mg/LTDZ的MS培养基。

优选的，步骤4)中所述生根培养用培养基为1/2MS培养基。