[发明专利]一种细胞原位单个囊泡内含物的检测装置及其检测方法

说明书

本发明提供一种细胞原位单个囊泡内含物的检测装置及其检测方法。所述检测装置包括：光学显微镜、微操纵仪、计算机工作站、AD/DA转换器、膜片钳放大器、红外相机和电化学电极系统；所述电化学电极系统包括：碳纤电极、玻璃微电极、参比电极、电解液和推进器。本发明操作方法简单，应用范围更广，在单个囊泡水平上，为神经递质的定性和定量研究提供了一种直接且高时间、空间分辨率的检测方法。

技术领域

本发明属于生物技术及医学检测技术领域，具体涉及一种细胞原位单个囊泡内含物的检测装置及其检测方法。

背景技术

流式细胞术是当今最常见的对单个细胞及其他生物粒子进行多参数、快速定量分析的方法之一，具有速度快、精度高、准确性好等特点，但该技术仅适用于微米级的细胞或者其他待分选颗粒，而无法对纳米级的囊泡(如突触囊泡、外泌体等)进行分离和分析。

目前，针对囊泡内含物进行检测的方法主要基于体外分离和裂解检测原理，并已应用于脂质体、嗜铬细胞、PC12细胞及儿茶酚胺能神经元等的囊泡内含物的定量检测(Omiatek et al.,2009,2010,2013)。然而，体外分离囊泡的过程容易引起损伤从而导致部分递质的流失，利用化学物质裂解囊泡膜的方法也很容易因为内含物的扩散丢失而导致检测结果被低估。

随后，Dunevall等人发现在直径约33μm的圆盘碳电极上施加一定电压，可以吸附和捕捉游离囊泡，并在接触瞬间击破囊泡膜，使得其包裹的递质得以流出并与碳电极发生氧化还原反应，从而记录到电化学电流(Dunevall et al.,2015；Li et al.,2018)。该方法一定程度上避免了药物裂解过程中囊泡内含物的扩散丢失。但是，这一方法仍无法解决体外分离囊泡的机械损伤致内含物泄露等问题。

在此基础上，Li等人又创新性地将直径为50-100nm的超微碳纤电极直接刺入PC12细胞内(Li et al.,2015)，同样可以记录到单个囊泡破裂后递质与电极间的电化学信号。该方法在一定程度上弥补了上述缺陷，是现有的相关技术中具有更高精确度的重要方法。然而，该方法采用极细的碳纤电极直接刺入细胞，在技术和应用方面仍然存在诸多难题：1，刺入式记录模式主要应用于培养的体积较大的细胞，这就意味着在更接近生理状态的脑片水平或者在体条件下很难实现相关的电化学记录。2，刺入式记录模式要求碳纤尖端极细从而限制了涂层修饰的应用。因此，该方法仅适用于个别可直接与碳纤电极发生反应的(电化学活性较高的)递质的检验，而对于其他神经递质如谷氨酸等，需要对碳纤电极进行特异性酶涂层修饰后才能实现电化学检测的成分，刺入式记录模式是很难实现的。3，刺入式记录模式在检测单个囊泡所含递质量的同时，无法有效检测细胞基质中游离神经递质的浓度。

因此，为了实现在脑片及在体水平上更精准得检验细胞原位单个囊泡内含物的检验，亟需找到更加行之有效的检测装置和检测方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种细胞原位单个囊泡内含物的检测装置及其检测方法。所述检测装置用于细胞原位单个囊泡内含物的检测，该检测方法可实现高灵敏度、高特异性的囊泡内含物的检测。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种细胞原位单个囊泡内含物的检测装置，所述检测装置包括：光学显微镜、微操纵仪、计算机工作站、AD/DA转换器、膜片钳放大器、红外相机和电化学电极系统；所述电化学电极系统包括：碳纤电极、玻璃微电极、参比电极、电解液和推进器。

本发明所述检测装置，将电生理和电化学技术相结合，该装置可以用于在更接近生理状态的脑片组织上进行单个囊泡所含成分的检验，即利用基本的电生理膜片钳技术，借助玻璃微电极对突触终末进行全细胞钳制，同时以通过玻璃微电极内嵌的碳纤电极为核心的电化学系统对囊泡内的神经递质进行检测。本发明所述装置操作方法简单，应用范围更广，在单个囊泡水平上，为神经递质的定性和定量研究提供了一种直接且高时间、空间分辨率的检测。