[发明专利]一种区分奇异变形杆菌和沙门氏菌的RPA引物及检测方法

说明书

本发明公开了一种区分奇异变形杆菌和沙门氏菌的RPA引物及检测方法。区分奇异变形杆菌和沙门氏菌的RPA引物由针对奇异变形杆菌毒力基因ureR的引物和针对沙门氏菌dnaN的引物组成；所述的针对奇异变形杆菌毒力基因ureR的引物为：上游引物ureR‑F：SEQ ID NO.1，下游引物ureR‑R：SEQ ID NO.2；针对沙门氏菌dnaN的引物为：上游引物dnaN‑F：SEQ ID NO.3，下游引物dnaN‑R：SEQ ID NO.4。本发明采用RPA扩增技术同时检测和区分这两种细菌，用时更短，更灵敏，无需PCR等昂贵设备，便于基层和大批量样本的快速检测使用。

技术领域

本发明涉及分子生物学应用技术领域，涉及一种区分奇异变形杆菌和沙门氏菌的RPA引物及检测方法。

背景技术

沙门氏菌是一种重要的食源性致病菌，在自然界分布广泛，主要通过受污染的肉蛋乳类水果蔬菜等食物和水源感染人类，可引起人得胃肠炎、伤寒、败血症等多种疾病。沙门氏菌血清型众多，达2500种。奇异变形杆菌是一种重要的条件致病菌，是仅次于大肠埃希菌的泌尿系统感染的主要病原菌，可引起败血症、食物中毒、腹膜炎、脑膜炎等。

奇异变形杆菌和沙门氏菌生化培养特征相似，且具有共同抗原，常常发生血清交叉凝集反应，因此采用常规血清检测方法无法正确区分两者。食品卫生指标中沙门氏菌是必检项目。奇异变形杆菌也是常见导致食品腐败的细菌和沙门氏菌检验中的常见干扰菌，但目前针对奇异变形杆菌的分子生物学检测方法很少。

RPA技术(重组酶聚合酶扩增)是2006年由英国TwistDx公司研发的一种等温核酸扩增技术。跟传统PCR技术相比，RPA技术有以下优点：1、无需PCR仪等昂贵设备，DNA扩增反应在37℃下恒温进行，即用一台水浴锅就可以进行；2、RPA技术灵敏性高于常规PCR，能够将痕量的核酸模板(1-10拷贝)扩增到可以检出的水平，相比PCR动辄几小时，RPA技术耗时更短，仅20min就可以完成核酸扩增。RPA技术相比常规PCR更为简便快捷灵敏，但因为RPA是在37-39℃下进行，对引物要求更高，否则容易出现核酸错误扩增。RPA技术没有PCR普及，目前还没有专业软件辅助设计RPA引物，主要依靠科研工作者凭自身专业知识来设计合适的RPA引物。因此目前尚没有公布的奇异变形杆菌的RPA检测方法。

现有沙门氏菌的检测技术一般针对沙门氏菌毒力基因invA或特异基因iroB等基因，但沙门氏菌型别多，仅血清型就有2500种。沙门氏菌毒力基因变异多，针对上述基因设计的引物广谱性不强。现有的针对沙门氏菌毒力基因invA或特异基因iroB等基因研发的核酸检测技术，往往仅采用几十株沙门氏菌进行验证，涵盖了仅仅少数常见血清型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强的区分奇异变形杆菌和沙门氏菌的RPA引物。

本发明的另一个目的在于提供准确、快速、简便的可同步检测奇异变形杆菌和沙门氏菌的分子生物学方法。

为实现上述第一个目的，本发明采用如下技术方案：

一种区分沙门氏菌和奇异变形杆菌的RPA检测引物，由针对奇异变形杆菌毒力基因ureR的引物和针对沙门氏菌dnaN的引物组成；所述的针对奇异变形杆菌毒力基因ureR的引物为：上游引物ureR-F：5’TATATGGTGCAAAAGGTGAGATTTGTATTA 3’(SEQ ID NO.1)，下游引物ureR-R：5’ACAGATTGTAATTCAGTTTCAGACAGTAC 3’(SEQ ID NO.2)；针对沙门氏菌dnaN的引物为：上游引物dnaN-F：5’GAACATTTATTAAAACCGCTTCAGCAGGTC 3’(SEQ ID NO.3)，下游引物dnaN-R：5’GTAAATTCAACTTCGCTTTGCCAGTCGTCAAG 3’(SEQ ID NO.4)。

本发明所述的RPA检测引物在制备沙门氏菌和奇异变形杆菌的鉴别试剂中的应用。