[发明专利]一种高产的流感病毒制备体系及制备方法

说明书

本发明公开了一种高产的流感病毒制备体系及制备方法，一方面利用缺失MARCH8的MDCK细胞进行流感病毒的制备，提高了产毒滴度，优化了基于哺乳动物细胞的流感病毒制备体系；另一方面利用不受MARCH8影响的带有M2突变的高产毒株进行流感病毒的制备，提高了在哺乳动物细胞和鸡胚中制备的流感病毒的产量，优化了利用哺乳动物细胞和鸡胚制备流感病毒的方法。

技术领域

本发明涉及病毒制备方法领域，尤其涉及一种高产的流感病毒制备体系及制备方法。

背景技术

流行性感冒是人类至今尚不能有效控制的传染病之一，其特点是在短期内突然爆发，迅速蔓延，造成不同程度的流行。除感染人外，流感病毒在动物体内也广泛存在并能引起猪、鸡、马等动物发病，导致动物的大量死亡。虽然有少数抗病毒药物对流感病毒的感染有一定疗效，但并不能完全消除流感病毒给人类造成的威胁，因此疫苗接种仍然是预防流感的得力措施。

目前接种传统的鸡胚灭活疫苗仍是预防流感的主要措施，但是基于哺乳动物细胞培养的流感疫苗在欧美国家已经上市,有替代传统疫苗的趋势。由于生产疫苗的哺乳动物细胞能够利用生物反应器进行大规模培养，同时与鸡胚来源的疫苗比较，在细胞上得到的流感疫苗可以产生较强的体液免疫反应和细胞免疫反应。近年来WHO积极支持和鼓励以哺乳动物细胞为基质生产流感疫苗。本申请建立了利用缺失MARCH8的MDCK细胞系制备流感病毒的方法，提高了流感病毒在哺乳动物细胞中的产量。同时，本申请建立了利用M2突变体构建流感病毒高产毒株的体系，提高了流感病毒在MDCK细胞及鸡胚中的产量，为满足市场对流感疫苗的需求提供新的技术方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产的流感病毒制备体系及制备方法，提高了流感病毒的产毒滴度。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明首先提供了一种高产的流感病毒制备体系，利用缺失MARCH8 的MDCK细胞系制备流感病毒或利用M2突变体制备高产毒株。其中：

缺失MARCH8的MDCK细胞系采用CRISPR-Cas方法敲除内源 MARCH8。

包含M2突变体的高产毒株为M2 K78R突变的毒株，例如A/PR8毒株。

所述制备流感病毒的哺乳动物细胞为MDCK细胞但不仅限于MDCK 细胞。

本发明还提供了一种高产的流感病毒制备方法，该方法利用缺失 MARCH8的MDCK细胞系制备或利用包含M2突变体的高产毒株制备。其中：

利用缺失MARCH8的MDCK细胞系制备流感病毒的步骤包括：

A1、lentiCRISPR-gMARCH8质粒的构建；

A2、制备转导用假病毒；

A3、筛选缺失MARCH8的MDCK细胞系；

A4、在缺失MARCH8的MDCK细胞中扩增流感病毒。

利用包含M2突变体的高产毒株制备流感病毒的步骤包括：

B1、MARCH8对M2及M2突变体蛋白表达的影响；

B2、免疫共沉淀Co-IP检测M2的泛素化；

B3、利用反向遗传学制备M2 K78R突变的流感病毒；

B4、利用M2 K78R突变制备的流感病毒，在MDCK细胞或鸡胚中扩增。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：