[发明专利]一种从人羊膜上皮细胞建立诱导性多能干细胞的方法

权利要求书

1.一种从人羊膜上皮细胞建立诱导性多能干细胞的方法，所述方法通过将包含OCT4、SOX2、KLF4、LIN28、L-MYC的cDNA以及p53的shRNA的6个重编程因子的2个以上oriP/EBNA1游离型质粒通过非脂阳离子转染试剂Neofect^TM导入人羊膜上皮细胞，使人羊膜上皮细胞重编程为诱导性多能干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人羊膜上皮细胞为体外培养两代以内的人羊膜上皮细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2个以上oriP/EBNA1游离型质粒同时导入人羊膜上皮细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述oriP/EBNA1游离型质粒为三个质粒，分别为pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL。

5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述转染后的人羊膜上皮细胞在原培养板上继续培养至诱导性多能干细胞克隆长大挑出。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤，获得的诱导性多能干细胞克隆挑出后，种在人重组玻连蛋白包被的培养板上，在TeSR^TM-E8^TM培养基中扩大培养。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将人羊膜上皮细胞接种到培养板中，以人羊膜上皮细胞培养基培养2天；

(2)更换新鲜的人羊膜上皮细胞培养基后，加入非脂阳离子转染试剂Neofect^TM和含有游离型质粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL的混合物，然后将混合物加入人羊膜上皮细胞培养基中转染；

(3)转染24小时后，更换TeSR^TM-E8^TM干细胞培养基，隔天更换新鲜培养基；

(4)挑出诱导性多能干细胞克隆，种在人重组玻连蛋白包被的培养板上，采用TeSR^TM-E8^TM培养基进行扩大培养，获得诱导性多能干细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

(1)步骤(4)扩大培养后的诱导性多能干细胞，采用无血清细胞冻存液冻存；

(2)取步骤(5)中少量细胞进行鉴定，表达干细胞标志物NANOG、OCT4、SOX2、TRA-1-60，即为诱导性多能干细胞。

9.据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

(7)对步骤(4)扩大培养后的细胞进行筛选，获得表达干细胞标志物NANOG、OCT4、SOX2、TRA-1-60的诱导性多能干细胞。

10.根据权利要求7-9任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，先将游离型质粒一起加入DMEM稀释至每种质粒浓度为0.05-0.01μg/μL，再与非脂阳离子转染试剂Neofect^TM混合均匀，并静置20分钟后，加入人羊膜上皮细胞培养基中。