[发明专利]稳定表达人转铁蛋白受体1细胞株的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种稳定表达人转铁蛋白受体1的细胞系及其在药物筛选中的应用，本发明提供了该细胞株的构建方法及其应用实例，包括(1)将hTfR1基因插入真核表达载体；（2）将步骤1得到的载体导入到宿主细胞中，经过加压筛选得到稳定表达hTfR1的细胞系；3）步骤2得到的细胞系用于药物筛选。

技术领域

本发明涉及一种稳定表达人转铁蛋白受体1(TfR1)细胞株的制备方法及其在药物筛选中的应用

背景技术

转铁蛋白(transferrin，Tf)是一类广泛存在于脊椎动物体液及其细胞中的单体糖蛋白家族，主要在肝脏合成，半衰期8天，血清浓度200–300mg/dL。成熟的Tf由679个氨基酸组成，分子质量约80kDa。晶体结构显示Tf的第1-336的氨基酸酸残基构成它的N端结构域，第337-679残基构成它的C端结构域。N端、C端结构域又由两个大小相同的小亚基构成。小亚基间的间隙是Fe结合位点，每分子的转铁蛋白能携带2个三价铁离子(Fe³+)。转铁蛋白与Fe³+的相互作用取决于pH，pH为7.4时，转铁蛋白与Fe³+高效结合，在酸性pH下两者分离。

转铁蛋白受体(CD7l)是参与铁的吸收和调节细胞生长的必需的蛋白。人体铁通过Tf运输，组织细胞通过Tf-TfR介导的内化过程实现铁的吸收。TfR1是一种II型跨膜糖蛋白，通过两个二硫键交联而成同源二聚体(180kDa)。其单体(含760个氨基酸，分子量为90-95kDa)包含一个大的胞外C端区域(671个氨基酸)，一个单跨膜区域(包含28氨基酸)及一个短的N端胞内调节区域(包含61氨基酸)。C端区域是一个外功能区，它包含Tf的结合位点。外功能区包含3个N-糖基化位点及一个O-糖基化位点，这些位点的糖基化作用是TfR1功能所必需的。

在高通量筛选、评估与transferrin结合或者靶向TfR1的药物(包括小分子化合物、短肽、基因工程改造的蛋白或抗体等)能否有效结合TfR1的过程中，需要使用一种快捷的transferrin-TfR1或药物-TfR1结合的体外细胞模型。本发明建立了HEK293F-hTfR1细胞模型，便于做transferrin介导的或者靶向TfR1的药物抗体或其它药物分子有效结合TfR1的细胞筛选模型。

发明内容

本发明提供一种稳定表达人转铁蛋白受体1细胞株的制备方法及其应用。

本发明提供的稳定表达人转铁蛋白受体1细胞株的制备方法，具体步骤如下：

将人源转铁蛋白受体1基因克隆到真核表达载体。

该真核表达载体具有如下特点：人源转铁蛋白受体编码基因TfR1与绿色荧光素基因(eGFP)处于同样的转录调控原件的控制之下，可以在哺乳动物细胞中共表达。

该真核表达载体具备在真核细胞中驱动外源基因表达的所有转录、翻译所需要的调控原件，包括启动子promoter、增强子enhancer、转录起始区、polyA加工和转录终止信号，以及核糖体结合区、翻译起始信号、翻译终止信号等；使TfR1与eGFP处于同样的转录、翻译调控原件控制之下，即处于同一个转录本或mRNA。

上述表达载体中人源TfR1和eGFP编码基因之间包含自剪切肽T2A序列，使其在同一开放读码框(ORF)中，由CMV启动子及其基因转录调控元件驱动TfR1和eGFP共表达。翻译后的多肽序列在T2A自剪切位点被切割成TfR1以及eGFP。TfR1通过二硫键的形式组成成熟的同源二聚体TfR1受体。

为了便于观察转染效率和基因在细胞中的表达，可在真核表达载体中加入可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GFP。载体开放读码框示意图如说明书附图1所示：

将上述步骤中获得的表达载体导入到宿主细胞中，经过筛选得到稳定表达且具有功能活性的人转铁蛋白受体1细胞株。