[发明专利]一种河流弧菌4个O抗原血清型的环介导等温扩增检测方法及应用

说明书

本发明涉及一种对河流弧菌O抗原血清型分型的环介导等温扩增（LAMP）检测方法及应用。本发明以河流弧菌O1，O4，O14和O17的O抗原基因簇内的特异基因，即wzy为靶基因，设计并筛选了对河流弧菌O1，O4，O14和O17的O抗原血清型分型的各自4条LAMP引物，并建立了对应的检测反应体系。利用本发明的LAMP方法检测河流弧菌，并且对其进行O抗原分型，具有操作简单、快速高效等优点。

技术领域

本发明涉及对河流弧菌O1，O4，O14和O17血清型菌株的环介导等温扩增（LAMP）技术及其制备方法。本发明还涉及利用所述的LAMP技术进行检测的方法。

背景技术

河流弧菌为革兰氏阴性菌，是海洋环境的主要栖息菌之一，广泛存在于河流和出海口环境水域，也是人类与水生生物主要的细菌性病原之一，可以起鱼、虾、贝等多种养殖动物的疾病，给养殖业带来严重的经济损失。河流弧菌还可以通过各种食物导致人类严重的流行性腹泻，是弧菌属中仅次于霍乱弧菌和副溶血弧菌的致病性弧菌，被认为是一种全球性的人兽共患的新型病原菌。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环等过程具有简单、快速的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

其技术原理为：60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。

扩增分两个阶段：第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的F1区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。

第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板，形成DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮的扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成。周而复始，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

血清学检测方法可有效区分一个种/属中不同致病性的菌株，对于致病菌的鉴定和流行病学调查具有重要意义。同一细菌不同血清型的O抗原多样性，是由于编码合成O抗原的各种酶的基因的遗传多样性决定的，这些基因往往成簇地位于基因组上的固定位点，被称作O抗原基因簇。前期研究中，我们发现，河流弧菌的O抗原基因簇信息已被破译，这使得采用分子生物学方法，以基因簇中的特异基因为目标，实现对河流弧菌的分子血清学检测成为可能。

发明内容

为实现上述目的，本发明公开了一种对河流弧菌O1，O4，O14和O17菌株进行O抗原血清型分型的LAMP引物，该引物含有FIP 引物、F3引物、BIP引物以及B3引物。其特征在于具有从河流弧菌O1，O4，O14和O17的wzy基因中分别选取得到的4个DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:16所示。