[发明专利]河流弧菌实时荧光PCR检测方法及应用

说明书

本发明涉及河流弧菌实时荧光PCR检测方法及应用。它是基于MGB探针的实时荧光PCR反应快速检测体系对河流弧菌进行检测和血清学分型。本发明以8种河流弧菌的特异性基因为靶基因，设计并筛选了针对每一个血清型的Taqman特异性引物及MGB探针，并建立了实时荧光PCR检测方法。利用本发明提供的方法可以准确、快速、灵敏地对8种血清型河流弧菌进行分子生物学检测。

技术领域

本发明属于细菌检测方法技术领域，涉及一种用于河流弧菌8种血清型菌株的实时荧光PCR检测方法及应用。

背景技术

河流弧菌是一种专性需氧的不形成芽孢的革兰氏阴性菌，属于条件致病菌，广泛分布于各种水源﹑牛奶﹑冰冻食品﹑土壤﹑植物根系﹑动物及人体中。河流弧菌引起的疾病中肺部感染占绝大多数，因其天然耐药, 感染常见于老年人, 体弱和长期应用多种抗菌药物的患者且大多数感染为医院感染。因此，对于河流弧菌的快速检测和溯源具有重要意义。

血清学检测方法可有效区分一个种/属中不同致病性的菌株，对于致病菌的鉴定和流行病学调查具有重要意义。目前，大多数重要致病菌都建立了基于表面多糖抗原的血清学分型系统，并且该分型体系已被广泛应用于检验检疫和疾病预防控制系统。

细菌表面多糖抗原主要包括O多糖（O抗原）、普通抗原（CA）、胞外多糖抗原、芽孢、以及荚膜多糖（K抗原）等。基于上述表面多糖抗原的多样性，细菌可被分为不同的血清型。同一细菌不同血清型的O抗原多样性，是由于编码合成O抗原的各种酶的基因的遗传多样性决定的，这些基因往往成簇地位于基因组上的固定位点，被称作O抗原基因簇。前期研究中，我们发现，河流弧菌的O抗原基因簇信息已被破译，这使得采用分子生物学方法，以基因簇中的特异基因为目标，实现对河流弧菌的分子血清学检测成为可能。

TaqMan-MGB实时荧光PCR（Real-time fluorescence PCR）技术原理是，将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光。随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，即可表征检测样品的类型和含量。

TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5'末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3'端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

TaqMan-MGB 探针是近年来在 TaqMan探针的基础上改进的一种新技术，它在探针3′端增加了MGB分子，这种物质能够提高探针的退火温度(Tm值) ，从而使它能够分辨 1个碱基的差别，完全配对，有荧光信号；只要有一个碱基不匹配，就没有信号。探针的设计首先为15-30nt长度，Tm为68-70℃。探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北京）合成，分别在5'和3'末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。引物的长度约为25nt，Tm在55-60℃之间。产生的PCR产物在50-200bp之间。引物由Invitrogen（中国上海）合成。如果正向引物的3'末端距离探针的5'末端1-20nt（通常为10nt或更少），则可能更好。