[发明专利]一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法

权利要求书

1.一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，所述方法具体为将BnXTH2基因在辣椒中进行过表达，其中，所述BnXTH2基因的完整的开放阅读框如SEQ IDNO:1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、BnXTH2基因过表达载体的构建；

1.1)提取植物整株的总RNA，反转录为cDNA；

1.2)以步骤1.1)得到的cDNA为模板，采用引物BnXTH2-F和BnXTH2-R进行PCR扩增，得到带酶切位点的BnXTH2的开放阅读框；

BnXTH2-F:CGGGATCCATGAGATCATCATCAAGTAGT；

BnXTH2-R:CGAGCTCCTAGTAGCCAGCGAGGCACT；

1.3)将表达载体pBI 121和BnXTH2片段进行酶切，酶切体系如下：

37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的PCR片段；

1.4)采用T4连接酶将步骤1.3)中得到的PCR片段与载体片段连接，具体体系如下：

16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化；

1.5)质粒提取：

将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；

1.6)转化EHA105：

利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌EHA105转化；

S2、对辣椒进行农杆菌侵染转化：

2.1)接种农杆菌至含30mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，摇菌至OD＝1.0；

2.2)4℃离心收集菌体，加入1/2MS液体培养基重悬，使其OD＝0.5，得到农杆菌重悬液；

2.3)将辣椒带柄子叶浸入农杆菌重悬液中20min后，20度下共培养2d转移至愈伤及分化培养基为：MS+0.6mg/L IAA+5.0mg/L 6-BA+300mg/LTim+100mg/L Kan，每2周更换一次培养基；

2.4)待长出丛生芽后移入芽伸长培养基为：

Ms+0.8mg/L IAA+2.0mg/L6-BA+2.0mg/LGA3 300mg/LTim+300mg/L Kan

2.5)后移入生根培养基1/2MS+0.5mg/LIAA，生根待根长为1cm左右后移入营养土中正常培养收获辣椒种子。

3.根据权利要求2所述的利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，还包括转BnXTH2基因辣椒抗寒冻能力鉴别；其中，将野生型与转BnXTH2基因T3代辣椒种子浸种催芽后播种于营养土中，15℃正常条件下培养到2-3片叶的幼苗期，将幼苗分别在(5±l)℃,(10±l)℃,(15±l)℃下处理,其中，在(15±l)℃下处理作为对照，第5d和第10d分别取样测定抗坏血酸及MDA含量；

不同低温处理后第5d测定幼苗的MDA含量低温处理第5d,转基因株系在(5±1)℃MDA的含量比非转基因株系低28.72％；转基因株系在(5±1)℃抗坏血酸含量的含量比非转基因株系高58.72％。