[发明专利]一种构建MSH2基因敲除细胞系的方法

说明书

本发明涉及一种构建MSH2基因敲除细胞系的方法，涉及基因工程技术领域。所述方法是采用CRISPR/Cas9系统来制备MSH2基因敲除细胞系，首先针对MSH2基因设计两个sgRNA序列，利用分子克隆技术构建重组质粒；然后将重组质粒转染至HeLa细胞，通过PCR验证sgRNA的活性后，进行嘌呤霉素药物筛选和单克隆化处理，然后提取单克隆细胞株基因组DNA以及总蛋白，进行MSH2基因水平测序鉴定以及蛋白水平表达检测，获得MSH2基因敲除HeLa细胞系。本发明构建的MSH2基因敲除HeLa细胞系是一种基因稳定遗传的细胞系。本发明提供的方法可用于MSH2基因的定向敲除致使其功能失活，具有简便、高效、快速、低成本等特点，对于MSH2基因功能和相关通路的研究具有重要意义。

【技术领域】

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种构建MSH2基因敲除细胞系的方法。

【背景技术】

人类MutS同源蛋白2(Human MutS homologue 2,hMSH2)是DNA错配修复蛋白家族的一个重要成员，通常定位于细胞核，与MSH3或MSH6形成异源二聚体，参与修复DNA合成中的碱基错配。hMSH2异位表达多见于各种肿瘤细胞，且可以被EBV病毒感染、H₂O₂刺激所诱导。异位表达的hMSH2可作为γδT细胞受体(γδT cell receptor,TCRγδ)的配体分子，被TCRγδ和NK细胞受体成员2D(Natural killer group 2member D,NKG2D)双重识别，介导γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

在DNA错配修复中，hMSH2蛋白质首先与hMSH6形成一种称为hMutSα二聚体复合物，并结合到DNA碱基错配区，然后与hMLH1和hPSM2基因形成的二聚体hMutLα结合，其中异源二聚体hMutSα起到识别带有缺口的新生DNA链的作用。hMutLα与hMutSα结合到DNA错配区后，即可激活与MutH蛋白有关的GATC核酸内切酶，这种酶可切出未修饰的甲基化GATC序列。依赖于MutS、MutL及DNA解旋酶(MutU)的协同作用，随着新生链错配区的切出，整个修复反应即被启动。

MSH2蛋白几乎出现于所有结肠正常粘膜，阳性率达94％。阳性产物定位于核内，部分细胞同时出现胞浆染色。阳性细胞分布于粘膜全层，腺窝下1/3-2/3中排列更为密集。

杯状细胞中偶见MSH2蛋白的表达。MSH2蛋白也表达在间质纤维母细胞、血管内皮细胞以及淋巴细胞上，呈核型或核浆型，但浆细胞内表达较少。

MSH2基因的突变与微卫星不稳定性和一些癌症有关。研究发现MSH2基因蛋白阳性表达率从正常组织、腺瘤不典型增生、腺瘤癌到腺癌逐渐降低，提示在腺瘤阶段已经有MMR的基因的突变或功能异常，并随其恶性程度的增加，MMR基因的突变频率也逐渐升高。研究表明MMR基因的突变，尤其是MSH2的突变可能是结直肠癌发生的早期事件之一。遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)，有时称为Lynch综合征，以常染色体显性遗传方式遗传，其中仅突变错配修复基因的一个拷贝的遗传就足以引起疾病表型，约占结直肠癌总数的15％～18％，占家族性结直肠癌的50％。MSH2基因的突变占该疾病相关基因改变的40％，与HNPCC相关的突变广泛分布在MSH2的所有结构域中，并且是MLH1突变的主要原因。另外MSH2和其他错配修复基因的突变也会导致DNA损伤未修复，导致突变频率增加。

已有学者已经证实错配修复蛋白MSH2蛋白在脑、肺脏、结肠、心脏、肌肉、脾脏、胃和前列腺等大部分脏器组织中的表达水平随着年龄的增长而逐渐下降，说明其与细胞衰老有着密切关联。