[发明专利]一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗

权利要求书

1.一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，以hACE2基因敲除的RNA干扰干细胞取代传统新冠病毒疫苗的腺病毒载体制备个体化治疗COVID-19疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，所述RNA干扰干细胞，包括敲除新冠病毒易感基因hACE2的干细胞和/或永生化干细胞、敲入新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰基因shRNA的干细胞和/或永生化干细胞；所述RNA干扰干细胞载体疫苗指将新冠病毒抗体产生基因敲入RNA干扰干细胞DNA。

3.根据权利要求1、2所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，所述RNA干扰干细胞载体疫苗，包括在同一干细胞中同时敲除新冠病毒易感基因hACE2、敲入新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰基因shRNA和新冠病毒抗体产生基因S1-RBD的干细胞和/或永生化干细胞。

4.根据权利要求1、2或3任一所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，所述干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、肺干细胞、诱导的干细胞或肺干细胞；所述永生化干细胞包括以SV40LT和/或hTERT基因转染的干细胞。

5.根据权利要求1所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，所述RNA干扰干细胞包括重组慢病毒载体的构建、重组慢病毒载体和包装质粒共转染293FT细胞进行慢病毒的包装、慢病毒转染、RNA干扰干细胞的筛选和鉴定。

6.根据权利要求1所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，所述重组慢病毒载体的构建包括将新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰序列shRNA和新冠病毒易感基因ACE2的互补双链克隆到慢病毒载体的多克隆位点。

7.根据权利要求1、6所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，所述新冠病毒M、N、E和/或S基因的siRNA序列见“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列”。

8.根据权利要求1所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，扩增所述hACE2基因的上游引物为：CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3；下游引物为：EF1-Rn：5’-GCCAGTACACGACATCACTT-3’；β-actin的上游和下游引物分别为：5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’、5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。

9.根据权利要求1所述的一种hACE2敲除的RNA干扰干细胞载体新冠疫苗，其特征在于，按以下步骤制备：

(1)获得间充质干细胞：从干细胞样本库或日常实验后剩余的样本中分离间充质干细胞和/或羊水成纤维细胞，或经干细胞诱导获得干细胞、肺干细胞。

(2)给干细胞装配永生化基因：构建携带hTERT和/或SV40LT的重组载体，转染干细胞，使干细胞DNA整合上hTERT和/或SV40LT基因，从而获得能永久生存、无限传代的新功能，可再经鉴定或诱导获得肺干细胞系。

(3)敲除干细胞的hACE2基因：从GenBank检索人ACE2核酸序列，下载其FASTA文件，进入www.genome-engeering.org，上传文件并筛选出评分较高的单导向RNA(sgRNA)序列，在每条sgRNA序列F链5’端添加CACC序列，R链5’端添加AAAC序列，与pX330质粒经Fast DigetBbs I酶切后的粘性末端形成互补，合成sgRNA寡链核苷酸(oligo)序列，以T4连接酶将双链sgRNA与pX330载体进行连接，然后转染干细胞，以敲除hACE2基因。

(4)给干细胞装配新冠病毒RNA干扰基因：优选新冠病毒(nCoV)的靶向干扰序列siRNA，合成shRNA模板，连接到慢病毒载体pHBLV或LV3，构建重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA或LV3-nCoV-N-shRNA，将重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA和包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体)或者将重组质粒LV3-nCoV-N-shRNA和包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞，包装携带shRNA的慢病毒，将慢病毒转染干细胞，使shRNA基因整合到干细胞DNA上，使干细胞获得能干扰nCoV在胞内复制的新功能。

(5)制成一种敲除hACE2基因、敲入RNA干扰基因和永生化基因的RNA干扰干细胞。

(6)将RNA干扰干细胞用作新冠病毒疫苗载体，替换现有技术的腺病毒载体，制备干细胞载体疫苗：根据GenBank分析SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列(RBD氨基酸为Gly319～Asn541)，采用氨基酸密码子同义置换，合成RBD肽段对应核酸的全基因(序列两端分别插入HindIII和Xho I的酶切位点)，将合成的RBD基因构建重组质粒(pGC-FU-RBD)，将重组质粒和包装质粒共转染293FT细胞，包装携带RBD的慢病毒，将慢病毒转染RNA干扰干细胞，使干细胞DNA整合上RBD，以获得能表达RBD蛋白及其抗体的干细胞载体疫苗。