[发明专利]Sip1Aa可溶性杀虫蛋白突变体

说明书

本发明涉及获得了Sip1Aa可溶性杀虫蛋白突变体，命名为Sip153‑248和Sip158‑243蛋白，属于生物技术领域。本发明将Sip1Aa蛋白氨基酸序列分别改变了两个氨基酸，获得的突变体蛋白Sip153‑248的杀虫活性提高了2.76倍，Sip158‑243的杀虫活性提高了2.26倍，且可溶性和稳定性均有一定的提高，有效的克服寻找苏云金芽胞杆菌表达蛋白对大猿叶甲有高毒力基因的难题、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及对鞘翅目农业害虫具有高毒力的Bt杀虫基因的定点突变及由该基因所编码的蛋白质。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种革兰氏阳性细菌，广泛存在于自然界中，其外形一般呈短杆状，单生或形成短链状。1911年，德国生物学家贝尔奈(Berliner)从德国苏云金的一种地中海粉螟的患病幼虫上分离得到同一种细菌，并命名为苏云金芽胞杆菌。苏云金芽胞杆菌已有100多年的研究历史，有关该菌的报道涉及生物分子学、细胞学、分类命名、Bt的有效成分以及其杀虫机理等方方面面，研究报告已有数万篇之多。

目前，国内外对Bt Sip蛋白的报道较少。Donovan等研究Bt菌株对鞘翅目昆虫的杀虫活性的过程中，发现一些菌株的培养上清液在致死中浓度(LC₅₀)为0.12(0.09～0.15)μg/mL时对科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)幼虫具有杀虫活性，该基因包含1104bp，编码367个氨基酸，被命名为Sip1A，与Mtx3杀蚊蛋白的相似性为46％(Donovan W P,Engleman J T,Donovan J C,et al.Discovery and characterization of Sip1A:a novel secretedprotein from Bacillus thuringiensis,with activity against coleopteran larvae[J].Appl Microbiol Biotechnol,2006,72(4):713-719)。2012年，本实验室从Bt菌株QZL26中克隆并鉴定了包含1038bp，编码345个氨基酸序列的sip基因，但其杀虫活性未见报道(刘艳杰,李海涛,刘荣梅,等.Bt新型基因sip的克隆、表达和生物信息学分析[J].生物技术通报,2012(12):101-105)。2013年，Murawska等人应用基因组测序技术，发现IS5056菌株中含有sip基因，但未进行深入研究。2015年，张金波从Bt菌株DQ89中克隆表达了1188bp，编码395个氨基酸的Sip蛋白，显示出对大猿叶甲具有较高毒杀作用，其LC₅₀值为1.542μg/mL(张金波,李海涛,刘荣梅,等.Bt菌株DQ89的sip基因的克隆、表达及杀虫活性分析[J].中国生物防治学报,2015,31(4):598-602)。此外，沙君雪从Bt菌株QZL38中克隆sip1Aa基因，进而构建其截短突变体，去除前90bp信号肽，可以产生37.6kDa的可溶性蛋白，并测试其对大猿叶甲的LC₅₀值为1.051μg/mL(Sha J,Zhang J,Chi B,et al.Sip1Ab gene from a nativeBacillus thuringiensis strain QZL38 and its insecticidal activity againstColaphellus bowringi Baly[J].Biocontrol ScienceTechnology,2018,28(5):459-467.)。