[发明专利]一种家蚕chorion peroxidase基因的克隆表达和纯化方法及其应用

说明书

本发明公开了一种家蚕chorion peroxidase基因的克隆表达和纯化方法及其应用，属于生物工程技术领域，构建含有His标签的载体，用基因特异性引物，通过PCR的方法获chorion peroxidase全长编码序列，将含有pET28a‑Cp重组表达载体的BL21菌液接种于含Kanamycin的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。分别取1ml诱导前和诱导后的菌液离收集菌体沉淀，并用PBS洗涤沉淀；确定蛋白在上清中表达后，过Ni‑NTA凝胶柱。本发明克隆表达了chorion peroxidase基因，并深入研究了它在卵巢发育中的功能，结果表明干扰该基因后，雌蛾产卵减少，滤泡细胞发育异常。

技术领域

本发明属于生物学技术领域，涉及一种家蚕chorion peroxidase基因的克隆表达和纯化方法及其应用。

背景技术

桑蚕又称家蚕，简称蚕，是以桑叶为食料的吐丝结茧的经济昆虫之一。桑蚕属鳞翅目，蚕蛾科，学名为Bombyx mori Linnaeus。桑蚕起源于中国，由古代栖息于桑树的原始蚕驯化而来，与中国现今食害桑树的野桑蚕同源，染色体都是28对。蚕蛾幼虫，吃桑叶，在化蛹前吐出作茧用的大量蚕丝是重要的纺织原料。桑蚕是完全变态昆虫，一生经过卵、幼虫、蛹、成虫等四个形态上和生理机能上完全不同的发育阶段。卵是胚胎发生、发育形成幼虫的阶段，幼虫是摄取食物营养的生长阶段，蛹是从幼虫向成虫过渡的变态阶段，成虫是交配产卵繁殖后代的生殖阶段。整个世代只幼虫期摄食，并为蛹和成虫期的生命活动积贮营养。

家蚕是中国古代最主要的经济昆虫之一。在家蚕养殖过程中，产卵量是一个关键的因素。现有技术中研究结果表明，家蚕产卵的快慢，既与品种有关，也与环境有关。如雌蛾的成熟程度，交配时间的长短，产卵时的温度，产卵时的光照，交配前的短时低温处理，斜面产卵等都影响产卵的速度。后来研究中发现家蚕的chorion peroxidase基因，目前为止，该基因在家蚕中的功能未知。

发明内容

本发明的目的在于提供一种家蚕chorion peroxidase基因的克隆表达和纯化方法及其应用，该方法克隆表达了chorion peroxidase基因，并深入研究了它在卵巢发育中的功能，结果表明干扰该基因后，雌蛾产卵减少，滤泡细胞发育异常。

其技术方案如下：

一种家蚕chorion peroxidase基因的克隆表达和纯化方法，包括以下步骤：

步骤1、构建含有His标签的载体，用基因特异性引物，通过PCR的方法获chorionperoxidase全长编码序列(氨基酸残基1-780)，引物序列如SEQ：ID：NO：1-SEQ：ID：NO：2所示。上游引物包含BamH I酶切位点，下游引物包含Sac I酶切位点，将含有酶切位点的全长与含有终止密码子的pET28a载体连接，防止移码突变。用双酶切筛选克隆并测序，分析测序结果，确认无氨基酸突变之后保存含有转基因质粒的菌液。提取转基因质粒并转入E.coliBL21感受态细胞获得可以表达Cp蛋白的菌株。

步骤2、将含有pET28a-Cp重组表达载体的BL21菌液接种于含Kanamycin的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。按1∶100将过夜的菌液接种到新鲜的含有Kanamycin的LB液体培养基中，37℃振荡培养约3h，至OD₆₀₀＝0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mM后继续震荡培养诱导蛋白表达6h。

步骤3、分别取1ml诱导前和诱导后的菌液离收集菌体沉淀，并用PBS洗涤沉淀。加入80μl PBS和20μl 5×SDS上样缓冲液后100℃煮沸10分钟。将样品与蛋白marker一起上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓度为12％的蛋白胶)。通过考马斯亮蓝染色确定蛋白是否诱导表达成功并判断蛋白分子量的大小。确定蛋白表达成功后，将诱导的菌液进行超声波破碎分别获得上清和沉淀，再进行SDS-PAGE确定蛋白表达在上清还是沉淀。