[发明专利]氨基酸同位素标记物的定量分析方法

权利要求书

1.氨基酸同位素标记物的定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、配制¹³C培养基和¹²C培养基；

S2、分别采用S1得到的¹³C培养基和S1得到的¹²C培养基培养细胞；

S3、细胞收集：弃去¹²C培养基和¹³C培养基，得到¹³C细胞和¹²C细胞进行衍生化前准备，得到¹³C样本和¹²C样本；

S4、MCF衍生化；

S5、采用GC-MS对衍生化溶液进行分析，氦气流的流速为0.5-1.5mL/min；进样口温度为270-300℃；柱升温程序如下：GC烤箱设置为42-48℃，维持1-2min后，以5-9℃/min速率升到170-185℃，维持4-8min后，以35-45℃/min速率升到210-230℃，维持4-8min后，以30-50℃/min速率升到240-250℃，维持10-15min后，以30-50℃/min速率升到260-290℃，维持1-4min；质谱离子原的温度为140-160℃；质谱四级杆温度为225-235℃；连接杆温度为245-255℃；

S6、数据挖掘获得氨基酸的碎片的荷质比、保留时间、¹³C可取代氨基酸的位置及个数，如下表：

2.根据权利要求1所述的氨基酸同位素标记物的定量分析方法，其特征在于，S1中，¹³C培养基中¹³C占20-70％。

3.根据权利要求1或2所述的氨基酸同位素标记物的定量分析方法，其特征在于，S3中的混合提取液为甲醇-氯仿混合提取液，甲醇和氯仿的体积比＝9:1。

4.根据权利要求1或2所述的氨基酸同位素标记物的定量分析方法，其特征在于，S4中，在常温条件下，向S3得到的¹³C样本和¹²C样本中分别加入1M氢氧化钠200μL，震荡10s后，再加入167μL甲醇和34μL吡啶，再加入20μL MCF(M＝94.5，密度＝1.22g/cm³)，振荡30s，再加入20μL MCF，振荡30s，加入400μL氯仿，再振荡混匀10s；最后加入50mM碳酸氢钠400μL，并以1000r/min的转速离心5min，弃上层液体，并加入无水硫酸钠吸取多余的水分，吸取下层的衍生化溶液。

5.根据权利要求3所述的氨基酸同位素标记物的定量分析方法，其特征在于，S4中，在常温条件下，向S3得到的¹³C样本和¹²C样本中分别加入1M氢氧化钠200μL，震荡10s后，再加入167μL甲醇和34μL吡啶，再加入20μL MCF(M＝94.5，密度＝1.22g/cm³)，振荡30s，再加入20μL MCF，振荡30s，加入400μL氯仿，再振荡混匀10s；最后加入50mM碳酸氢钠400μL，并以1000r/min的转速离心5min，弃上层液体，并加入无水硫酸钠吸取多余的水分，吸取下层的衍生化溶液。

6.根据权利要求1、2或5所述的氨基酸同位素标记物的定量分析方法，其特征在于，S5中，扫描速度为1.562μ/s。

7.根据权利要求1、2或5所述的氨基酸同位素标记物的定量分析方法，其特征在于，S5采用pulsed splitless的分流方式。