[发明专利]一种提升级联催化体系效率的多酶有序共固定化方法

说明书

本发明涉及一种提升级联催化体系效率的多酶有序共固定化方法。具体地，本发明公开了一种多酶共固定阵列催化材料，所述催化材料包含有序共固定于固相基底表面的第一酶和第二酶，以前述催化材料催化多酶级联反应时，所述催化材料的所述第一酶在催化完前一反应后，所述催化材料中的所述第二酶可立即用于后一反应的催化，从而可显著提升整个多酶级联反应的催化效率。

技术领域

本发明涉及酶工程和酶固定化技术领域，具体地涉及一种提升级联催化体 系效率的多酶有序共固定化方法。另外，本发明还涉及使用有序共固定的蔗糖 合成酶与糖基转移酶，应用于高效制备皂苷类药学活性化合物。

背景技术

生物催化剂酶在生产实践中有着广泛的应用。酶的固定化通过物理或化学 的方法将游离酶结合于固相基质载体，有助生物催化剂与反应溶液分离，实现 酶的循环利用，降低生成成本。由于复杂催化体系多涉及多种酶参与的连续反 应，构成了多酶级联催化。发展多酶体系的共固定化，不仅可将不同酶的催化 特性有机结合，促进酶催化效能，而且有助酶分子稳定性改善，利于保存运输。 但多数情况下，常规的多酶共固定方法(包括交联，截留和直接附着功能基质 表面)常会导致各种酶分子的随机分布，形成的级联酶间的随机共固定化。由 于在级联多酶随机共固定化中，酶分子间存在空间位阻或过于分散，从而会显 著降低级联多酶催化反应的协同性。许多功能紧密相关的多酶，在自然界中已 进化成在细胞器和细胞膜上区隔共定位，或构成多酶复合物。这种多酶间特殊 的空间邻近排布，一定条件下会产生出底物通道效应，避免反应中间体的溶液 扩散，促进中间体在酶分子间传递，来保持代谢物的局部高浓度，利于生物体 内发生高效的多步代谢反应。受自然界级联多酶空间共定位底物通道现象的启 发，设计构建级联多酶的有序共固定化体系，通过相关酶催化位点的邻近阵列 排布，有望促进人工级联体系中多步连续反应的效率。已报道的多种酶有序共 固定化的方法主要利用支架介导的共定位，例如，使用DNA折纸，RNA或肽作 为支架来共固定多酶。然而很多有应用价值的酶(例如脱氢酶，过氧化氢酶和 许多糖基转移酶)多是由多亚基构成的寡聚酶。利于支架分子有序共固定化多 聚酶的化学计量是复杂的，使得基于分子支架构建有序共固定多亚基酶技术复 杂化，常需对酶-支架连接设计进行广泛地优化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可显著提升多酶级联反应催化效率的多酶共固 定阵列催化材料。

本发明的第一方面，提供了一种多酶共固定阵列催化材料，所述催化材料包 含如下部分：

1)多酶纳米自组装体，包含两类以上级联催化体系的元件酶和配对酶以及融 合于所述元件酶和/或所述配对酶上的组氨酸标签，其中，

所述元件酶为寡聚酶分子，且所述寡聚酶分子的亚基上融合有自反应肽段或 者自反应化学对，并且任选地融合了组氨酸标签；

所述配对酶为功能酶分子，且所述功能酶分子的亚基上融合有自反应肽段或 者自反应化学对，并且任选地融合了组氨酸标签；

所述元件酶和所述配对酶通过各自融合的自反应肽段或者自反应化学对间的 自发链接反应获得所述多酶纳米自组装体；和

2)Ni²⁺：NTA表面功能化的固相基底，其中，Ni²⁺通过NTA结合于固相基底 表面；

所述多酶纳米自组装体通过所述组氨酸标签与所述Ni²⁺配位结合，实现与所述Ni²⁺：NTA表面功能化的固相基底的固定结合。

在另一优选例中，所述多酶纳米自组装体包含2-5类级联催化体系的元件酶和 配对酶，较佳地2-3类，更佳地2类(如1类元件酶和1类配对酶)。

在另一优选例中，所述组氨酸标签是多价的，如2价。

在另一优选例中，所述自反应肽段选自下组：SpyTag、SpyCatcher、或其组合。