[发明专利]玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法及检测试剂盒有效
| 申请号： | 202011377946.1 | 申请日： | 2020-12-01 |
| 公开（公告）号： | CN112322712B | 公开（公告）日： | 2021-08-31 |
| 发明（设计）人： | 刘静远;印丽萍;张宁;易建平 | 申请（专利权）人： | 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心 |
| 主分类号： | C12Q1/686 | 分类号： | C12Q1/686;C12Q1/6888;C12N15/11 |
| 代理公司： | 上海市汇业律师事务所 31325 | 代理人： | 王函 |
| 地址： | 200135 上*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 玉树 无钩蝠蛾 实时 荧光 pcr 检测 方法 试剂盒 | ||
1.一种玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 设计引物和探针；
该引物的序列为：
上游引物YSF3为如SEQ ID NO：7 所示序列：5’- GTTGCAAGAATTGCATCAAATG -3’；
下游引物YSR3为如SEQ ID NO：8 所示序列：5’- AGATCGTAAAGGCCCATAATTG -3’；
该探针的序列为：
玉树无钩蝠蛾探针YS-P3为如SEQ ID NO：9 所示序列：5’-AAATTTATAATAGCCAAAGCTATT -3’ ，荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团连接在3’末端；
(2) 提取玉树无钩蝠蛾DNA；
(3) 采用步骤（1）设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测，用以区分玉树无钩蝠蛾和其它冬虫夏草寄主昆虫。
2.如权利要求1所述的玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤（2）具体为：取玉树无钩蝠蛾虫及虫草样放入研钵，加液氮磨成粉末状，用试剂盒提取样品DNA。
3.如权利要求1所述的玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25μL，包括2×Premix Ex Taq12.5μL，50×ROXReference Dye0.5μL，步骤（1）设计的上下游引物YSF3和YSR3各1.0μL，浓度为5μmol/L，YS-P3探针1.0μL，浓度为5μmol/L，DNA模板2.0μL，超纯水补至25μL。
4.如权利要求1或3所述的玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为：预变性95℃ 10min；然后95℃ 15sec，60℃30sec 循环40 次。
5.一种引物和探针组在实时荧光PCR检测玉树无钩蝠蛾中的应用，其特征在于，所述引物序列为：
上游引物YSF3为如SEQ ID NO：7所示序列：5’- GTTGCAAGAATTGCATCAAATG -3’；
下游引物YSR3为如SEQ ID NO：8所示序列：5’- AGATCGTAAAGGCCCATAATTG -3’；
所述探针序列为：
玉树无钩蝠蛾探针YS-P3为如SEQ ID NO：9所示序列：5’- AAATTTATAATAGCCAAAGCTATT-3’，荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团连接在3’末端。
6.一种试剂盒在实时荧光PCR检测玉树无钩蝠蛾中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物和探针，所述引物如下：
上游引物YSF3为如SEQ ID NO：7所示序列：5’- GTTGCAAGAATTGCATCAAATG -3’；
下游引物YSR3为如SEQ ID NO：8所示序列：5’- AGATCGTAAAGGCCCATAATTG -3’；
所述探针如下：
玉树无钩蝠蛾探针YS-P3为如SEQ ID NO：9所示序列：5’- AAATTTATAATAGCCAAAGCTATT-3’，荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团连接在3’末端。
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