[发明专利]一步法去宿主DNA并富集微生物的方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于去宿主DNA并富集微生物的试剂盒，包括细胞裂解液、DNA酶、消化缓冲液和EDTA溶液；所述细胞裂解液为洋地黄皂苷溶液；所述DNA酶为Turbo DNase和benzonase；所述消化缓冲液包括MgCl₂、Tris，MnSO₄、BSA、NaCl、KCl，Mg₃(PO₄)₂、CaCl₂、(NH₄)₂SO₄和DTT。本发明还公开了一种去宿主DNA并富集微生物的方法，从样本开始到去宿主DNA结束，宿主DNA游离和降解一步反应完成，无需离心，无需PBS清洗等复杂操作，在加入EDTA溶液灭活后，终溶液直接用于提取核酸。操作十分简单，在20分钟即可完成样本的去宿主DNA，提升了效率，能够满足自动化处理的要求。

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及样本微生物分子生物学分子检测样本的前处理，具体涉及宿主的肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水、全血等样本的去宿主DNA、富集微生物的方法。

背景技术

宏基因组测序对微生物病原的检测，和传统的培养鉴定方法相比，具有鉴定周期短、覆盖广、操作简易等优势。面对临床很多不明原因的微生物感染鉴定，宏基因组测序覆盖全面的优势也越来越明显。很多病人的感染并不是单一微生物引起的，宏基因组测序得到的微生物之间的相对丰度的信息，为临床医生做出正确的诊疗方案，提供了宝贵的数据支持。

目前高通量测序是宏基因组测序的主力军，包括二代测序和三代测序，但是这两种测序平台都会面临相同的问题，那就是临床样本含有大量的宿主DNA，不同类型样本所含宿主DNA背景有着较大的差别，以人的临床样本为例，人脑脊液中的人源细胞约为3×10⁴/mL，全血中约有7×10⁶/mL的人源细胞，而胸腹水中约有7×10⁷/mL的人源细胞，假设相同拷贝数的病原菌，出现在以上不同人源背景的溶液中，那对于高通量测序而言，在相同的检测数据量的前提下，将会有几个数量级的检测灵敏度的差异。在高人源DNA的背景下，检出低丰度病原菌序列非常困难，更不必说，通过宏基因组测序来做病原微生物的分型和耐药基因等更深入的分析。如何能够高效去除人源DNA背景，且最大限度的保留样本溶液中微生物的含量，提高病原微生物的阳性检出率，成为宏基因组测序必须要解决的问题。

目前的去宿主DNA方法中，英国的Grady教授基于纳米孔测序技术建立了一套去宿主DNA的技术路线。该方法，先离心样本溶液得到PBS悬浮液，再通过破坏宿主细胞膜游离宿主DNA，然后通过HL-SAN酶降解宿主DNA，再离心收集细菌为主的微生物菌体。整个流程操作繁琐，中间又需要多次离心样本，没法实现自动化流程，多次的离心和PBS清洗难免会对原有的微生物稳态有所破坏，只能收集细菌为主的微生物，对某些微生物的副作用明显，如肺炎链球菌、病毒类等。而目前市场上其他的去宿主DNA产品，同样也存在富集微生物不全面、难以实现自动化的问题。目前去宿主方法繁琐，是因为没有一种有效消化宿主DNA的方法，裂解细胞后宿主DNA的溶液环境复杂，DNA很难完全游离在溶液中，不易被DNA酶消化。

可见，目前去宿主DNA的技术领域亟需一种高效、快速且微生物覆盖全面的，可实现全自动化的去宿主方法。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明为了克服目前去宿主技术上操作复杂、成本高、费时费力、富集微生物不全面、微生物富集效果不理想、无法实现去宿主流程自动化等缺点，提供一种高效、简易、低成本的快速去宿主DNA的试剂盒及方法。