[发明专利]一种高效装载特异性miRNA的功能性外泌体构建方法

权利要求书

1.一种高效装载特异性miRNA的功能性外泌体构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、利用MS2噬菌体衣壳蛋白，将MS2蛋白编码基因与外泌体Lactadherin蛋白中的C1C2结构域相连接，构建C1C2-MS2慢病毒质粒；

S2、将用于与MS2铆合的位点pac蛋白与目的miRNA相连，构建pac-miRNA-pac慢病毒质粒，其两端均具有与MS2结合的pac位点；

S3、将步骤S1和步骤S2获得的两种质粒包装为慢病毒感染间充质干细胞，通过抗性药物筛选获得确定的稳转系，留取干细胞上清液，利用超速离心法提取外泌体；

步骤S3的具体过程：

S3.1、将C1C2-MS2慢病毒质粒和pac-miRNA-pac慢病毒质粒分别利用三质粒慢病毒包装系统，通过转染293T细胞，包装得到CM慢病毒和p-miRNA-p慢病毒；

S3.2、无菌条件下，将胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞PMSCs加入含有干细胞培养基中，置于37℃、CO₂体积分数为5％的培养箱内孵育；所述干细胞培养基中含有质量百分比10％的胎牛血清；

S3.3、通过CM慢病毒感染PMSCs，48小时后利用含有1.0ug/mL puromycin的培养基进行药物筛选，10-14天后获取稳定表达MS2的细胞系CM-PMSCs；

S3.4、将CM-PMSCs进一步感染p-miRNA-p慢病毒，48h后利用含有600μg/mL G418的培养基进行药物筛选，2周后获取稳定表达目的miRNA的细胞系CM-miRNA-PMSCs；

S3.5、利用含有质量百分比10％的无外泌体血清的干细胞培养基孵育CM-miRNA-PMSCs，24-48h收集细胞上清液，超滤浓缩后，通过超速离心法与外泌体提取试剂盒，获得高效装载目的miRNA的外泌体CM-miRNA-Exo。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3.2中，所述干细胞培养基由高糖DMEM与DMEM-F12以体积比1：1比例配制而成，并含有100U/mL青链霉素、10ng/mL成纤维细胞生长因子和10ng/mL表皮生长因子。