[发明专利]一种治疗COVID-19的基因改造干细胞

权利要求书

1.一种治疗COVID-19的基因改造干细胞，其特征在于，将新冠病毒的易感基因ACE2插入已被SV40LT和/或hTERT转染的永生化干细胞DNA中，制备易被新冠病毒感染的易感干细胞，进而将新冠病毒M、N、E和/或S基因的RNA干扰序列shRNA插入所制易感干细胞DNA中，构建既能通过ACE2将新冠病毒吸入干细胞内又能通过shRNA靶向干扰新冠病毒在干细胞内复制并能在体外无限传代扩增的基因改造干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种治疗COVID-19的基因改造干细胞，其特征在于，所述干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、肺干细胞或诱导肺干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种治疗COVID-19的基因改造干细胞，其特征在于，所述插入基因包括重组慢病毒载体的构建、重组慢病毒载体和包装质粒共转染293FT细胞进行慢病毒的包装、干细胞的慢病毒转染、基因改造干细胞的筛选和鉴定。

4.根据权利要求1、3所述的一种治疗COVID-19的基因改造干细胞，其特征在于，所述重组慢病毒载体的构建包括将新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰序列shRNA和/或将新冠病毒易感基因ACE2克隆到慢病毒载体的多克隆位点。

5.根据权利要求1所述的一种治疗COVID-19的基因改造干细胞，其特征在于，所述新冠病毒M、N、E和/或S基因的siRNA序列见“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列”。

6.根据权利要求1所述的一种治疗COVID-19的基因改造干细胞，其特征在于，扩增所述hACE2基因的上游引物为：CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3；下游引物为：EF1-Rn：5’-GCCAGTACACGACATCACTT-3’；β-actin的上游和下游引物分别为：5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’、5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。

7.权利要求1所述的一种治疗COVID-19的基因改造干细胞，其特征在于，按以下步骤制备：

(1)获得间充质干细胞：从干细胞样本库、产前诊断后剩余羊水细胞、新生儿脐带血细胞、脐带组织或胎盘组织细胞中分离、诱导羊水成纤维细胞、间充质干细胞或肺干细胞。

(2)给干细胞装配永生化基因：构建携带hTERT和/或SV40LT的重组载体，转染干细胞，使hTERT和/或SV40LT整合到干细胞DNA，制备能无限传代的永生化干细胞或肺干细胞。

(3)给干细胞装配新冠病毒易感基因：将血管紧张素转换酶II基因连接慢病毒表达载体pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro或pGC-FU，分别构建重组质粒pHBLV-OE-ACE2或pGC-FU-ACE2，将重组质粒pHBLV-OE-ACE2和包装质粒(psPAX2和pMD2G)或者将重组质粒pGC-FU-ACE2和包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)分别共转染293FT细胞，包装携带ACE2的重组慢病毒OE-ACE2或FU-ACE2，将重组慢病毒转染干细胞，使ACE2基因整合到干细胞DNA。

(4)给干细胞装配新冠病毒RNA干扰基因：优选新冠病毒(nCoV)的靶向干扰序列siRNA，合成shRNA模板，连接到慢病毒载体pHBLV或LV3，构建重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA或LV3-nCoV-N-shRNA，将重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA和包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体)或者将重组质粒LV3-nCoV-N-shRNA和包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞，包装携带shRNA的慢病毒，将慢病毒转染干细胞，使shRNA基因整合到干细胞DNA上，使干细胞获得能干扰nCoV在胞内复制的新功能。

(5)制成一种人工装配永生化基因、新冠病毒RNA干扰基因和易感基因从而兼具干细胞固有治疗功能、人工永生化功能、新冠病毒RNA干扰功能和易感特性的基因改造干细胞。