[发明专利]博卡病毒小肠上皮类器官感染模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种博卡病毒小肠上皮类器官感染模型的构建方法，其中，该方法包括：小肠上皮类器官的分离与培养；博卡病毒感染小肠上皮类器官。该模型的解决了博卡病毒尚无体外分离培养的方法的问题，尤其是消化道感染模型，同时用于快速评估博卡病毒的传染性，以及为博卡病毒感染肠道的致病机理提供了新的实验基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的涉及博卡病毒小肠上皮类器官感染模型的构建方法。

背景技术

人博卡病毒(human bocavirus,HBoV)是瑞典学者Tobias Allander等通过分子筛选发现的一种新的细小病毒，其氨基酸序列与犬细小病毒(canine minute virus,CMV)氨基酸序列的同源性为43％，与牛博卡病毒(bovine parvovirus,BPV)氨基酸序列的同源性为42％。属于细小病毒科，博卡病毒属，为正二十面体的无包膜单链线性DNA病毒，基因组全长5.2kb，含3个开放读码框，分别编码非结构蛋白NS1、NP1和结构蛋白VP1/VP2，HBoV的基因组保守性相对较好，VP1/VP2基因的多样性相对较多。

人博卡病毒作为一种新发现的病原体，是对ARTIs的病毒性病原谱的重要补充。由于其在上呼吸道感染中占有一定的比例，特别是能引起严重的下呼吸道感染，引起各国科学家和临床工作者的高度重视，对该病原体的研究也逐步深入。自2005年被发现以后，世界范围内均有在呼吸道、血清、粪便及尿液标本中检测出HBoVs DNA的报道。由于HBoVs DNA序列相对保守，其检测主要是通过PCR方法扩增其DNA片段进行，但普通PCR方法费时费力，出于检测目的迫切需要，采用高灵敏度和特异度的实时荧光定量PCR(Real time PCR)，可以大大提高HBoV的检出速度，实现病毒DNA的定量。

目前，研究报道呼吸道感染患者的呼吸道标本中HBoV的阳性检出率为0.8％～19％，胃肠道疾病患者粪便或尿标本中的检出率为0.8％～9.1％。HBoVs男性感染率高于女性，为1.5-2.5:1。HBoVs DNA阳性患者年龄分布从几天到60岁不等，年龄6个月至2岁的儿童阳性率最高，而6个月以下的婴幼儿感染率相对较低。目前，在成人患者中较少研究HBoVs，且成人标本中HBoVs DNA检出率较低为0％-1.5％。与呼吸道合胞病毒相似，HBoVs感染无明显的季节性，但目前的报道以冬季为主。HBoVs阳性的呼吸道和胃肠道标本中常有其它病原体的共同检出，中位混合感染率为42.5％，常见混合感染病原体包括鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和轮状病毒等。

最近新的HBoV病毒被相继报道，分别命名为人类博卡病毒2(HBoV2)、人类博卡病毒3(HBoV3)和人类博卡病毒4(HBoV4)；目前为止尚未确定4种人博卡病毒是各代表不同的病毒体，还是单一病毒的不同基因型。为清楚地将Allander等最初发现的人博卡病毒与新发现的HBoV2-4区分，有报道称其为HBoV1。目前为止，HBoV1和HBoV2在呼吸道及肠道标本中均有检出，HBoV3和HBoV4是最新被发现的博卡种属，HBoV4仅在肠道标本中被检出。

HBoV1 DNA最初在下呼吸道感染患儿的呼吸道标本中检出，且检出率高于其他病毒，被认为是下呼道感染的新病原。现已报道与其相关的呼吸道疾病有肺炎、支气管炎、鼻炎、咽喉炎和哮喘等，我国各地陆续有呼吸道和胃肠道博卡病毒感染的报道，呼吸道以HBoV1为主，胃肠道以HBoV2报道多见，近年报道以HBoV1为主的胃肠道感染地区也渐趋多见，HBoV1-4均有检出报道。各地腹泻病例博卡病毒检出率差异较大，报道最高的达25.77％，因此，博卡病毒极可能成为继轮状病毒，肠腺病毒，人杯状病毒后主要的致腹泻病毒之一。

一些研究报道HBoV1与重症肺疾病及儿童喘息密切相关，携带HBoV1的哮喘患儿50％以上为单一HBoV1感染，而混合感染儿童则较少诊断为哮喘。目前为此，尚无与HBoVs有关的死亡病例的报道。由于HBoVs常与其它病原体共同检出，而目前尚无有效的体外培养体系和敏感的动物模型，故难以确定其在呼吸道疾病中的传染性和致病性。