[发明专利]一种用于快速检测乙型肝炎病毒基因的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.用于快速检测乙型肝炎病毒的引物，所述引物为重组酶聚合酶扩增DNA引物：

引物1-5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3′

引物2-5′-TCCCGTGCTGGTTGTTGAGGATCCTGGAATTAGAG-3′。

2.权利要求1所述引物用于制备快速检测乙型肝炎病毒的试剂盒的应用。

3.一种用于快速检测乙型肝炎病毒的试剂盒，包括：重组酶聚合酶扩增体系和Cas13反应体系；

所述重组酶聚合酶扩增体系包括TwistAmp液态重组酶聚合酶扩增试剂盒和重组酶聚合酶扩增DNA引物：

引物1-5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3′

引物2-5′-TCCCGTGCTGGTTGTTGAGGATCCTGGAATTAGAG-3′

所述Cas13反应体系包括重组CRISPR-Cas13a蛋白、单链引导RNA和单链RNA探针

单链引导RNA：

5′-ACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGACAAACGGGCAACAUACCUUGAUAGUC-3′

单链RNA探针：

5′-FAM-TUUUUUC-BHQ-1-3′。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述重组酶聚合酶扩增体系包括：

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述Cas13反应体系包括：

。

6.权利要求3-5任一所述试剂盒检测乙型肝炎病毒基因的方法，包括如下步骤：

1)重组酶聚合酶扩增

(1)取HBV阳性对照稀释成3x10⁵拷贝/μl，3x10⁴拷贝/μl，3x10³拷贝/μl，3x10²拷贝/μl，3x10拷贝/μl，取1μl加入以下反应体系：

(2)加入1.25μl的20x核心反应混合液，混匀离心；

(3)加入1μl模板(不同稀释度的质粒模板和阴性对照)；

(4)在管盖上加入1.25μl乙酸镁(MgOAc，280mM)；

(5)颠倒混匀，离心后39度孵育20min。

2)用Cas13蛋白检测HBV

(1)取上述1ul反应产物加入Cas13反应体系，加入384孔透明圆底酶标板充分混合；设3个复孔：

(2)反应时间30min；

(3)检测：用多功能酶标仪检测仪，检测480nm激发光520nm发射波长的荧光强度。