[发明专利]一种白芨种子的无菌保存方法

说明书

本发明主要涉及中药种植技术领域，公开了一种白芨种子的无菌保存方法，包括果荚的采集、果荚表面处理及灭菌、种子取出和分装、种子的保存、组培育苗几个步骤。本发明方法保存白芨种子成本低，操作简便，方法简单，可进行批量处理和保存，白芨种子保存半年后，发芽率能够达到73％。本发明方法保存的种子，组培育苗成本低，可以快速获得无菌繁殖体系，不受季节限制，在短期内获得大量种苗；本发明方法保存的种子设置几道防线，在保持种子萌发率的同时，将种子播种污染率降到最低。

技术领域

本发明属于中药材组织培养技术领域，具体涉及一种白芨种子无菌低温保存方法。

背景技术

白芨(Bletilla striata(Thunb)) Reich.f) 为兰科白芨属多年生草本植物，全球白芨属植物约有6种，均分布于亚洲，我国有4种，主要分布于冀、京、陕、甘、滇、苏、皖、浙、赣、闽、湘、黔等省。白芨以其干燥块茎入药，具有收敛止血，消肿生肌等功效，是我国重要的传统中药材之一。主要用于咳血、吐血、外伤出血、疮疡肿痛、皮肤皲裂等症；白芨具有延缓衰老、增稠、悬浮、保湿等持性，被广泛用于食品，医药以及化妆品行业中。另外，白芨因其花色艳丽，有较高的观赏价值，也是一种很多的景观植物。近年来，受药用和花卉市场需求的影响，白芨用量逐年加大，因人工无节制挖掘，生态环境遭到严重破坏等因素，导致野生白芨自然资源急剧减少，濒临灭绝，被国家列为重点保护的野生药用植物之一。保护野生白芨自然资源，推广应用植物组织培养育苗技术和人工规范化、规模化、集约化种植势在必行，对白芨资源的保护具有重要的意义。

近年来，在白芨组织培养技术方面的研究报导较多，白芨组织培养技术己经较为成熟。以种子为外植体的无菌播种方式，因其操作简单、污染率低、种子量大、周期短，可在短时期内建立起无菌繁殖体系，已被大家广泛采用，成为白芨最主要的组培育苗方法。白芨种子主要集中于每年9-10月成熟，种子成熟后果荚表皮极易失水裂开，长时间保存较难，果荚表皮裂开后，大大增加播种污染率，需在果荚裂开前及时播种。一旦果荚破裂，一方面种子容易染菌，另一方面种子与灭菌药液接触，影响出苗率。另外果荚的果柄和果蒂由于带有褶皱，灭菌不彻底，极易带菌。即使将果荚经灭菌后保存在3-5度的低温环境中，保存时间也最多20天左右，时间过长易滋生霉菌，明显增加播种污染率，影响播种效果。

专利号为CN201711244877.5 “一种白及种子超低温保存方法”是在室温下将未损坏的白及果荚打开，用镊子使白及种子转入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育30～60min，再将其放入梯度降温盒中放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在-35℃ ～-60℃，再将降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用。该发明方法在转入冻存管时，未对白及果荚进行消毒，容易带入病菌，污染种子，另外此方法采用液氮保存，较为繁琐，不易操作，且成本高。专利号为CN201210296768.9的“一种白及种子的保存方法”是将经过洗涤的白及蒴果置于超净工作台上，用酒精灯明火外焰进行烘烤，烘烤的温度为400～500℃，烘烤时间为3～6秒；再放入低温冰箱保存。该方法使用酒精灯明火外焰进行烘烤，烘烤的温度为400～500℃，烘烤时间为3～6秒，不容易控制，会导致蒴果烘烤过度或者有些没有烘烤到而消毒不全，造成污染。CN201410230993.1 的“一种白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法”，是将消毒剖开的种子投入藻酸钠包埋液，搅拌均匀后滴入钙离子包埋液中，置于室温下凝固成包埋珠；将包埋珠置于PVS2溶液中脱水处理20-160min；放入冷冻管中，并加入PVS2溶液，然后将冷冻管置于液氮中冷冻保存。本方法一方面使用了液氮成本高；另一方面使用PVS2溶液，并且发明人也指出PVS2溶液对材料也存在一定的毒性，需要严格控制脱水的时间。这些因素也可能导致白及种子萌发率低。专利号为CN201610285243.3 的“一种适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法”的专利，在采收及保存时保留蒴果的果柄，会造成消毒不完全，从而造成播种污染率高。

综上所述，目前缺少一种简单、实用、有效、成本低、播种污染率低，可长时间无菌保存白芨种子的方法。若解决好白芨种子的无菌保存问题，可根据生产需求，适时播种，减少浪费，降低生产成本，提高生产效率。

发明内容