[发明专利]一种可诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型构建方法

权利要求书

1.一种可诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型构建方法，其特征在于，先通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术对Ly6G基因位点进行编辑，获得Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型；再对Ly6G-DTR基因敲入小鼠注射白喉毒素，获得经白喉毒素诱导的中性粒细胞100%特异性剔除的小鼠模型；所述Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型的构建，具体包括以下步骤：

1）确定打靶序列：针对Ly6G基因2个靶序列分别为：

Ly6G-sgRNA1：5‘- TCTGCAGAAGGACTGAAACC AGG -3’

Ly6G-sgRNA2：5‘- CAAGGATGAAGGTCATTGAA TGG -3’

2）通过体外转录获得Cas9 mRNA和sgRNA1/2；

3）通过生物合成获得重组模板DNA：设计重组模板DNA序列，包含以下元件：5‘和3’同源臂、T2A连接序列、DTR序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

4）获得Ly6G-DTR基因敲入Founder小鼠：将Cas9 mRNA、sgRNA1/2和重组模板DNA按一定比例混合，然后通过显微注射操作系统将其注射入小鼠受精卵细胞中，进一步将存活的受精卵细胞移植入假孕ICR小鼠雌鼠输卵管，获得Founder小鼠；

5）对Founder小鼠进行基因型检测，筛选出基因组中DTR序列插入而且插入位点正确的小鼠个体，获得Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型；

通过间隔2-3天以低剂量腹腔注射白喉毒素的方式，获得经白喉毒素诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）具体包括如下步骤：

A．将获得的Founder小鼠抽提基因组DNA；

B．以获取的基因组DNA为模板，使用DTR特异性引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，初步筛选出目标DTR序列在基因组中有插入的小鼠；

C．将具有目标DTR序列扩增条带的样本挑选出来，再分别使用针对左侧同源臂和针对右侧同源臂的引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，筛选出DTR序列在基因组中插入位置正确的小鼠；

D．将DTR序列插入而且插入位点正确的小鼠挑选出来，将以上3段PCR产物分别测序，挑选出插入目标序列正确的个体，即为Ly6G-DTR基因敲入小鼠。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤B中DTR特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR反应体系如下：F和R引物各 0.2 μL，2×Taq Master Mix 5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10 μL；PCR反应程序如下：预变性95℃ 5min；变性94℃ 30sec，退火60℃ 30sec，延伸72℃ 40sec，35个循环；终止反应72℃ 10min；将PCR产物进行凝胶电泳检测，若有516 bp的扩增条带，表明DTR序列在基因组中插入。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤C中针对左侧同源臂的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；针对右侧同源臂的引物核苷酸序列如SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR体系如下：F和R引物各 0.2 μL，2×TaqMaster Mix 5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10 μL；PCR反应程序如下：预变性95℃5min；变性94℃ 30sec，退火60℃ 30sec，延伸72℃ 90sec，35个循环；终止反应72℃10min；将PCR产物进行凝胶电泳检测，若针对左侧同源臂引物有1428 bp 的扩增条带且针对右侧同源臂引物有1081 bp 的扩增条带，表明DTR序列插入而且插入位点正确。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低剂量为20 ng/g体重。