[发明专利]一种糖基转移酶突变体及其催化合成莱鲍迪苷A的方法

说明书

本发明公开了一种糖基转移酶突变体及其催化合成莱鲍迪苷A的方法，所述原糖基转移酶的氨基酸序列：SEQ ID NO:1，本实验从UGT76G1的表面残基Q、N、T出发，并结合溶剂可及表面面积、B‑因子等方面数据分析结果，在所得预测的基础上，筛选出Asn196,Asn78,Asn400,Asn69,Gln72,Gln198,Gln178,Gln160,Thr319,Thr 81中的单点或多点迭代突变，最终筛选出较好的突变菌株76G1_Q72E‑N196D‑T319E的UGT‑SuSy体系，实现高效催化合成莱鲍迪苷A。将糖基转移酶UGT76G1或其突变体基因于蔗糖合酶基因连接得到重组质粒，构建双酶共表达的重组菌株。通过构建双酶系统，实现体内UDPG的再生，有效解决了昂贵糖基供体的来源问题，降低了成本，推动了生物技术工业的应用。该突变体制备简单，实现短时间高效催化合成莱鲍迪苷A，且生物酶催化方法绿色环保无污染，更适合于现在绿色工业加工生产。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种糖基转移酶突变体及其催化合成莱鲍迪苷A的方法。

背景技术

甜菊糖苷属于四环二萜类化合物，易溶于水和二恶烷，可溶于部分有机试剂。耐热性好，见光不易分解。甜菊糖苷的基本骨架为四环二萜醇苷，由于糖基的种类、添加的位置（C13，C19）以及糖基数目的不同形成甜菊糖苷类化合物的多样性。主要包括甜菊醇，甜菊苷，莱鲍迪苷A、B、C、D、E、M等。其中甜菊苷（Stevioside，St苷）在甜叶菊中含量最高，其次为莱鲍迪苷A（Rebaudioside A，RA苷），约占叶片干重的3.8 %。

莱鲍迪苷A（Rebaudioside A, RA苷）是一种来源于甜叶菊的天然甜味剂，高甜度、低卡路里，能很好地满足现代人对健康饮食的甜味需求。目前，RA苷主要通过提取法获取，还可以通过酶法转化，由甜叶菊来源的糖基转移酶UGT76G1催化甜菊苷（Stevioside, St苷）获得。甜叶菊来源的糖基转移酶UGT76G1（UDP-glycosyltransferase 76G1）是“Leloir”型糖基转移酶，属于GT1家族，通常以UDPG为糖基供体合成糖苷类化合物。UGT76G1最早由HUMPHREY T V和RICHMAN A 等报道。糖基转移酶UGT76G1最初从甜叶菊中提取，后可由大肠杆菌或酿酒酵母等异源表达大量获得，用于催化St苷一步合成RA苷。前期糖基供体UDPG原料成本较高，限制了UGT76G1的大规模应用。随着UDPG生产方式的不断改进，可通过SuSy等用酶法大量合成。研究者在此基础上使用SuSy-UGT级联反应体系，运用SuSy为UGT76G1提供糖基供体，实现UDPG的循环利用，大大缩减了应用成本。对于UGT76G1-SuSy级联体系中，SuSy为糖基化反应顺利进行提供所需的糖基供体，当UDPG再生速度不成为限制时（例如可通过提高蔗糖浓度），合成RA苷效率高低的关键在于UGT76G1。甜叶菊来源的UGT76G1在大肠杆菌中的可溶表达量很低，限制了糖基转移酶的高效应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种糖基转移酶突变体，及利用该糖基转移酶突变体催化合成莱鲍迪苷A的方法；利用该突变基因实现甜菊苷的糖基化修饰，高效催化制备得到莱鲍迪苷A，并为工业化生成提供一定借鉴。

为了实现上述目的，本申请采用的技术方案为：

一种适用于莱鲍迪苷A合成的糖基转移酶突变体，糖基转移酶氨基酸序列由SEQID NO:1所示氨基酸序列从Asn196，Asn78，Asn400，Asn69，Gln72，Gln198，Gln178，Gln160，Thr319，Thr 81中的单点或多点迭代突变，突变经以下至少一种突变所得：

N196D为SEQ ID NO:1序列中第196位氨基酸由天冬氨酰（N）突变成天冬氨酸（D）;

N78D为SEQ ID NO:1序列中第78位氨基酸由天冬氨酰（N）突变成天冬氨酸（D）;

N400D为SEQ ID NO:1序列中第400位氨基酸由天冬氨酰（N）突变成天冬氨酸（D）;