[发明专利]检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒及方法

说明书

本发明涉及针对牛结节性皮肤病病毒的特异性引物组合物，还涉及检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒以及方法。本发明针对牛结节性皮肤病病毒的保守序列，设计了至少两组特异性引物对，进一步建立了检测试剂盒和方法。本发明提供的试剂盒和方法灵敏度高，扩增时间更短，效率更高，还能够鉴定样品中含有牛结节性皮肤病病毒是来自于疫苗免疫还是自然感染，是对现有牛结节性皮肤病病毒检测方法的有力补充。

技术领域

本发明涉及动物病毒分子生物学检测方法领域，具体涉及牛结节性皮肤病的核酸检测试剂盒及检测方法。

背景技术

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)，是由牛结节性皮肤病病毒(Lumpyskin disease virus，LSDV)引起的一种牛的痘病，属于痘病毒科脊椎动物痘病毒亚科山羊痘病毒属，与牛痘病毒并不同属。该病的临床特征包括发热，皮肤、粘膜和内脏器官出现结节，机体消瘦，淋巴结肿大，皮肤水肿，部分病例会死亡。该病还能够引起产奶量暂时性下降，引起公牛暂时或永久性不育，损坏皮张，甚至因为继发细菌感染而导致动物死亡，从而对经济造成严重的影响。该病的发病率在5％～45％之间，病死率达10％，不感染人。该病是世界动物卫生组织(OIE)的通报性疾病(OIE 2014年版名录)，是我国《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中的一类传染病，澳大利亚(澳大利亚2013年版名录)、加拿大(加拿大2014年版名录)、美国(美国国家动物卫生通报系统疾病名录)、欧盟(欧盟动物疫情通报系统疾病名录)的通报性疾病。2010年以来，确认在此期间曾发生或正在发生该病的国家多达43个，分布于非亚欧三大洲，其中非洲疫情尤为严重。2019年8月12日，经中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病研究中心确诊新疆维吾尔自治区伊犁州发生LSD疫情，这是我国首次确诊发生该病。截止2020年7月，全国已有福建长汀、江西赣州、广东潮州、安徽黄山、浙江金华等地确诊发生LSD疫情，给当地造成巨大的经济损失。

LSDV常用的检测方法为病毒分离鉴定、血清学检测方法以及分子生物学检测方法。病毒分离鉴定周期长且需要在一定级别生物安全实验室进行，病毒中和试验是特异性最高的血清学检测方法，但由于动物机体对LSD病毒感染主要表现为细胞免疫应答，仅产生低水平的中和抗体，因此该方法敏感性欠佳。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过比对分析GenBank上公布的LSDV全基因组序列，找到LSDV的保守基因，然后针对该保守基因设计了特异性引物和探针，进一步建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒和方法。本发明提供的试剂盒和方法灵敏度高，扩增时间更短，效率更高，是对现有LSDV检测方法的有力补充。

第一方面，本发明提供针对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的特异性引物组合物。

本发明所述特异性引物组合物包含至少两对特异性引物对；其中一对特异性引物对的扩增目的基因具有如SEQ ID NO:1的序列，另一对特异性引物对的扩增目的基因具有如SEQ ID NO:2所示的序列。

如SEQ ID NO:1所示的序列在本发明中又称为LSDV-LD126基因。

如SEQ ID NO:2所示的序列在本发明中又称为LSDV001基因。

在一些实施方案中，针对具有如SEQ ID NO:1所示序列的目的基因的引物对包括：具有如SEQ ID NO:3所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:4所示序列的反向引物。

在一些实施方案中，针对具有如SEQ ID NO:2所示序列的目的基因的引物对包括：具有如SEQ ID NO:6所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:7所示序列的反向引物。

第二方面，本发明提供与上文所述特异性引物组合物配合使用的探针。

在一些实施方案中，与以具有如SEQ ID NO:1所示序列为扩增目的基因的特异性引物对配合使用的探针具有如SEQ ID NO:5所示的序列。