[发明专利]苏云金芽胞杆菌Sip1Aa蛋白随机重组突变蛋白

说明书

本发明涉及苏云金芽胞杆菌Sip1Aa蛋白随机重组突变蛋白，属于生物技术领域。本发明获得了Sip1Aa高效可溶性杀虫蛋白突变体M6和M8蛋白，分别改变了一个氨基酸，获得的突变体蛋白M8的杀虫活性提高了4.02倍，M6的杀虫活性提高了2.19倍，有效的克服寻找苏云金芽胞杆菌表达蛋白对大猿叶甲有高毒力基因的难题、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及对鞘翅目农业害虫具有高毒力的Bt杀虫基因的随机重组突变蛋白。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种革兰氏阳性细菌，广泛存在于自然界中，其外形一般呈短杆状，单生或形成短链状。1911年，德国生物学家贝尔奈(Berliner)从德国苏云金的一种地中海粉螟的患病幼虫上分离得到同一种细菌，并命名为苏云金芽胞杆菌。苏云金芽胞杆菌已有100多年的研究历史，有关该菌的报道涉及生物分子学、细胞学、分类命名、Bt的有效成分以及其杀虫机理等方方面面，研究报告已有数万篇之多。

目前，国内外对Bt Sip蛋白的报道较少。Donovan等研究Bt菌株对鞘翅目昆虫的杀虫活性的过程中，发现一些菌株的培养上清液在致死中浓度(LC₅₀)为0.12(0.09～0.15)μg/mL时对科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)幼虫具有杀虫活性，该基因包含1104bp，编码367个氨基酸，被命名为Sip1A，与Mtx3杀蚊蛋白的相似性为46％(Donovan W P,Engleman J T,Donovan J C,et al.Discovery and characterization of Sip1A:a novel secretedprotein from Bacillus thuringiensis,with activity against coleopteran larvae[J].Appl Microbiol Biotechnol,2006,72(4):713-719)。2012年，本实验室从Bt菌株QZL26中克隆并鉴定了包含1038bp，编码345个氨基酸序列的sip基因，但其杀虫活性未见报道(刘艳杰,李海涛,刘荣梅,等.Bt新型基因sip的克隆、表达和生物信息学分析[J].生物技术通报,2012(12):101-105)。2013年，Murawska等人应用基因组测序技术，发现IS5056菌株中含有sip基因，但未进行深入研究。2015年，张金波从Bt菌株DQ89中克隆表达了1188bp，编码395个氨基酸的Sip蛋白，显示出对大猿叶甲具有较高毒杀作用，其LC₅₀值为1.542μg/mL(张金波,李海涛,刘荣梅,等.Bt菌株DQ89的sip基因的克隆、表达及杀虫活性分析[J].中国生物防治学报,2015,31(4):598-602)。此外，沙君雪从Bt菌株QZL38中克隆sip1Aa基因，进而构建其截短突变体，去除前90bp信号肽，可以产生37.6kDa的可溶性蛋白，并测试其对大猿叶甲的LC₅₀值为1.051μg/mL(Sha J,Zhang J,Chi B,et al.Sip1Ab gene from a nativeBacillus thuringiensis strain QZL38 and its insecticidal activity againstColaphellus bowringi Baly[J].Biocontrol ScienceTechnology,2018,28(5):459-467.)。

从理论上来说，PCR扩增是一个指数增长的过程，但是实际上，PCR的扩增曲线并不是标准的“J”形指数曲线，而是接近于“S”形的曲线。发生这种情况是因为随着PCR扩增循环数的增加。扩增规模呈指数型迅速增大，Taq酶、dNTPs、引物、甚至是DNA模板等各种PCR反应的要素逐渐供不应求，进而导致PCR的效率越来越低，产物增长的速率也就逐渐减缓。当所有PCR所需的原料都被消耗掉以后，PCR就进入了平台期，PCR产物的量也达到饱和。由于各种因素之间复杂的相互作用，不同PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大的差异。