[发明专利]一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备及防治应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备及防治应用，所述的枯草芽孢杆菌株DR‑22，菌株保藏号为CGMCC NO：19784：该菌具有生长速度快、产孢量高、抗逆性强、活性产物丰富、菌体蛋白高等。本发明特色在于枯草芽孢杆菌固体发酵技术及菌体蛋白制备技术，制备过程包括以下步骤：(1)菌株活化，得到活化的菌株；(2)扩增培养，制备菌液的种子液；(3)发酵培养，制得菌剂；(4)菌体蛋白制备：发酵菌体、烘干、粉碎过筛、浸提沉淀、等电点酸沉淀、离心收集沉淀、干燥去除水分、菌体蛋白。本发明最终防效能够达到73.76％，且防治效果稳定，为防治烟草花叶病毒病提供了很好的生物防治的选择。

技术领域

本发明属于农业微生物防治领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备及防治应用。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物，其经济价值较高。而烟草花叶病毒病是烟草生产上分布最广、发生最为普遍、危害最为严重的一大类病害，是严重影响烟草健康生长的主要障碍之一。烟草花叶病病烟草植株感染病毒后，叶绿素受破坏，光合作用减弱，叶片生长被抑制，叶小、畸形，减产幅度可达20％～80％。病毒病发生后，还严重影响烟叶的品质，使品质变劣。

目前，对于烟草花叶病毒病主要的防治方式为栽种抗耐病品种、化学药剂的使用以及轮作倒茬，这三种主要的防治方法有着不同的弊端，目前大田生产缺乏高抗或者抗病品种，而且抗病品种选育时间较长，一般需要5到6年。化学药剂的使用较之简单但却效果差、还会对农田造成污染，其主要原因是烟草花叶病毒是完全细胞内寄生，化学药剂很难发挥效果。而轮作倒茬又因为土地限制而难以发挥作用。

为解决上述所存在的问题以及弥补现有技术的空缺，充分提高植物对病毒病免疫能力的提高，本发明一种来源于枯草芽孢杆菌固体发酵产物中菌体蛋白的制备及对烟草花叶病毒病的防治应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备及防治应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备及防治应用，其特征在于：所涉及的枯草芽孢杆菌DR-22，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,

分类命名：枯草芽孢杆菌；Bacillus subtilis；

保藏号：CGMCC No.19784；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2020年5月08日。

一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备，所述的枯草芽孢杆菌株DR-22，菌株保藏号为CGMCC NO：19784。

一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌株活化，将低温保存的枯草芽孢杆菌置于平板培养基上活化，在26℃下培养24h，制得活化菌株；

(2)扩增培养，将步骤(1)制得的活化菌株再次接种于100mlLB液体培养基中，在29℃下，150r/min振荡培养12h，制得该菌剂的种子液；

(3)发酵培养，将步骤(2)制得的种子液按照1％的接种量接种于固体培养基中进行发酵，在30℃下，200r/min进行恒温培养，当观察至其活孢子数≥1000亿/克时，停止发酵，制得具有防治烟草花叶病毒病的枯草芽孢杆菌菌剂。

优选地，所述菌体蛋白制备：发酵菌体、烘干、粉碎过筛、浸提沉淀、等电点酸沉淀、离心收集沉淀、干燥去除水分、菌体蛋白，其步骤(4)制备的菌体烘干在39℃下烘40h，烘干后粉碎过筛为60目。

优选地，所述步骤(4)浸提沉淀为正己烷以1:5的料液比对菌体粉进行浸提沉淀，时间为3h，之后过滤，保留沉淀则为脱脂后菌体蛋白，重复3次。