[发明专利]一种编辑CYP4F8基因的系统及其用途

说明书

本发明涉及CYP4F8基因的编辑，尤其是筛选到针对CYP4F8的敲除效率较高的sgRNA序列，其包含的间隔子序列如SEQ ID NO：14所示。

技术领域

本发明属于基因工程和基因遗传修饰技术领域，涉及基于CRISPR/Cas9技术的CYP4F8基因的编辑及其用途。

背景技术

CYP4F8是一种细胞色素P450单加氧酶，其可以将COX产物氧化并羟基化为19-羟基-PGE2。PGE2可以刺激各种前列腺受体亚型，而19-羟基-PGE2则对EP2受体亚型表现出选择性。在前列腺癌中，EP2受体与PGE2的结合可以诱导血管内皮生长因子(VEGF)的分泌、细胞运动、生长和血管生成。有研究表明，即使部分敲低CYP4F8的表达也会显著降低前列腺癌细胞的细胞活力。因此，CYP4F8的前列腺特异性的表达谱以及19-羟基-PGE2对EP2受体的激活表明，抑制CYP4F8可能是一种有吸引力的治疗前列腺癌的方法。

发明内容

目前，CRISPR技术作为一种新的基因组工程化工具，由于其操作简单，靶向精确，已被广泛应用于细胞的基因组编辑和免疫疗法的开发中。最常用的包括II型、V型、VI型等CRISPR系统。以II型CRISPR系统为例，在外源DNA入侵时，来自CRISPR重复阵列的转录物被Cas9和RNase III核酸酶加工为成熟的crRNA，随后与tracrRNA和Cas9组成复合体。通过识别PAM，crRNA将该复合体引导至靶标DNA，并通过crRNA包含的间隔区序列与靶DNA的结合，解开DNA双链，再由Cas9中的HNH结构域剪切crRNA的互补DNA链，RuvC结构域剪切非互补链，最终在靶标DNA处引入双链断裂。人们还发现，引导Cas9结合并切割特定的DNA序列不需要RNA复合物。通过使用设计的嵌合单向导RNA(sgRNA)可以简单地实现该过程。

术语“单向导RNA”或“sgRNA”是指通过将crRNA和tracrRNA分子融合成“单个向导RNA”的人工工程化RNA，当与Cas9蛋白结合时，其能够识别并切割向导RNA特异性的DNA靶标。sgRNA一般包含间隔子序列(spacer)和骨架序列，这两个序列可以在同一个分子中或不同的分子中。间隔子序列的作用是指导Cas9蛋白切割与间隔子序列互补的DNA位点，也即靶序列。一般而言，间隔子序列是与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交、并且指导CRISPR复合物与该靶序列特异性结合的任何多核苷酸序列。间隔子序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50％或更多。一般间隔子序列的长度为约20个核苷酸。骨架序列为sgRNA中必须的，除间隔子序列之外的其余序列，一般包含tracr序列和tracr配对序列，这些序列一般不会因为靶序列的变化而改变。由于骨架序列不影响sgRNA对靶序列的识别，因此，骨架序列可以是现有技术中任何可行的序列。骨架序列的结构可参见如文献Nowak et al.Nucleic AcidsResearch 2016.44:9555-9564。

在本文中可采用的骨架序列如下表1所示。

表1.示例性的sgRNA骨架序列

sgRNA，尤其是其中间隔子序列的设计需要考虑很多因素，例如长度、碱基组成、靶基因的结合位置、与非靶标位点的结合率、是否包含SNP、二级结构等等。目前已经可以通过各种在线工具来设计sgRNA。然而，由于Cas酶可以切割任何邻近PAM位点的靶序列，针对特定的靶基因而言，在线工具设计的大量sgRNA的编辑效率都不尽相同，甚至差异很大，例如，PAM位点是5'-NGG-3'的编辑效率通常就比5'-NGA-3'或5'-NAG-3'的高。因此，筛选特异性高的sgRNA对于CRISPR系统编辑效率的提高至关重要。

因此，在第一个方面，本发明提供一种靶向CYP4F8的sgRNA，其包含的间隔子序列如SEQ ID NO：14所示。

在一个优选的实施方案中，所述sgRNA还包含选自SEQ ID NO：1-12的骨架序列。