[发明专利]一种玉米致死性坏死病多重RPA检测方法

说明书

本发明属于植物病毒检测方法领域，特别涉及一种玉米致死性坏死病多重RPA检测方法，包括样品的核酸提取，反转录，RPA反应特异性检测，电泳，判断样品是否携带MCMV和SCMV两种病毒。本发明的方法特异性良好，灵敏度较高，反应时间短。

技术领域

本发明属于植物病毒检测方法领域，特别涉及一种玉米致死性坏死病多重RPA检测方法。

背景技术

甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员，主要由蚜虫以非持久性方式传播，也可汁液和种子传播。SCMV侵染植物后在叶片表面形成花叶症状，也可造成植株矮化，引起玉米矮花叶病。玉米矮花叶病属于世界性病毒病害，其中甘蔗花叶病毒北京分离物(SCMV-BJ)是引起我国北方玉米产区玉米矮花叶病的优势株系。

玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)，主要由汁液、介体甲虫、蓟马传播，也可种传。MCMV侵染植物后可造成寄主植物叶片褪绿、斑驳，也可造成坏死斑点、卷曲、叶尖坏死、矮化等症状。MCMV是我国重要的检疫性有害生物。在我国，MCMV和SCMV复合侵染引起玉米致死性坏死病(Maize lethal necrosis disease,MLND)，造成玉米产量损失惨重。

目前，检测SCMV的方法主要有血清学检测、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等；MCMV的检测方法主要有血清学检测、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)、逆转录重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)等。血清学检测方法是一种用于常规检测的有效方法，但是该方法需要特异性的抗体，制作抗体过程繁琐、费时较长。利用分子生物学建立的RT-PCR、RT-LAMP方法检测结果更为快速、灵敏，但所需要的检测设备和探针试剂成本较高。

RPA(Recombinase polymerase amplification)是一种新型的DNA等温扩增技术，可以灵敏、特异、快速地扩增模板DNA，也可现场检测植物病毒，目前尚未发现利用RPA技术同时检测两种植物病毒的报道。

发明内容

本发明提供的一种玉米致死性坏死病多重RPA检测方法，特异性良好，灵敏度较高，反应时间短，使得整个检测方法高效、便捷、省时。

本发明提供了一种玉米致死性坏死病多重RPA检测方法，包括以下步骤：

S1，提取样品的总RNA；

S2，对S1提取的总RNA进行反转录；

S3，RPA反应特异性检测：用甘蔗花叶病毒和玉米褪绿斑驳病毒的特异性RPA引物进行RPA扩增；

所述甘蔗花叶病毒的特异性RPA引物为SCMV-F，SCMV-R，玉米褪绿斑驳病毒的特异性RPA引物为MCMV-F和MCMV-R；

SCMV-F的引物序列如SEQ ID NO.1所示；

5’-CAAGATATATCAAACACTAGAGCAACTAAG-3’

SCMV-R的引物序列如SEQ ID NO.2所示；

5’-GAAGTCATTTCATAGAAATCGAAAGCATAC-3’

MCMV-F的引物序列如SEQ ID NO.3所示；

5’-CTCTCCGATTACATGTTATCAATACCCACTG-3’

MCMV-R的引物序列如SEQ ID NO.4所示。