[发明专利]一种利用多重DPO-RT-PCR检测花生矮化病毒及番茄环斑病毒的试剂盒

说明书

本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及一种利用多重DPO‑RT‑PCR检测花生矮化病毒及番茄环斑病毒的试剂盒。本发明的试剂盒包括DPO‑PCR引物对，本发明在多重PCR中引入DPO引物技术，可以大大提高多重PCR技术的灵敏度及特异性。本发明建立PSV及ToRSV双重DPO‑RT‑PCR检测方法，为口岸实验室对其的快速筛查提供参考。

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及一种利用多重DPO-RT-PCR检测花生矮化病毒及番茄环斑病毒的试剂盒。

背景技术

我国是大豆主要进口国，具海关数据显示，2017年我国大豆进口量实现6连涨，达到9553万吨，创历史新高。进口大豆虽能满足油脂市场的需求，但携带大量外来有害生物。花生矮化病毒（Peanut stunt virus，PSV）及番茄环斑病毒（Tomato ringspet virus，ToRSV）属于我国进境植物检疫性有害生物，是植物种传病毒，可随带毒种子远距离传播，均存在通过染病大豆传入我国的风险。目前口岸主要使用DAS-ELISA和RT-PCR方法对两种病毒进行检测，时间长，通量低，因此建立高通量的病毒检测方法对提高口岸检测效率有重要意义。

多重PCR（multiplex PCR）技术首先被Chamberlain等（1988）用于检测杜氏营养不良症，现在已经在病原微生物的鉴别、遗传病诊断及法医学等方面广泛应用。多重PCR同时扩增多个目的基因片段，提高了扩增效率，具有高效性、特异性强及操作简便等优点，但多重PCR反应体系需设计两对及两对以上引物，所以引物设计是该技术的关键。双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）是一种新型PCR引物设计方法，具有特异性高，引物自身及引物间难形成二级结构，引物设计简单等优点，目前已经广泛的应用于如大丽轮枝菌、黑白轮枝菌、向日葵白锈病菌，向日葵黑茎病菌、油菜茎基溃疡病菌、番茄斑萎病毒等植物病害的检测中。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用多重DPO-RT-PCR检测花生矮化病毒和/或番茄环斑病毒的试剂盒。本发明在多重PCR中引入DPO引物技术，可以大大提高多重PCR技术的灵敏度及特异性。本发明建立PSV及ToRSV双重DPO-RT-PCR检测方法，为口岸实验室对其的快速筛查提供参考。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种利用多重DPO-RT-PCR检测花生矮化病毒和/或番茄环斑病毒的试剂盒，所述试剂盒包括DPO-PCR引物对，所述DPO-PCR引物对的序列如下：

PSV-DPOf：ACCTTTTGGGTTCAATTCIIIIIGGTCAATTT；

PSV-DPOr：ATGGACAACCCGTTCACCAGIIIIIACTGTTTAG；

或

ToRSV-DPOf：TGTAATGTAGTGGTATGTTAAGIIIIIACTAACTTA；

ToRSV-DPOr：CCTGCGAAAACAACGTCCTIIIIITAGTTAAGAT；

其中，“I”表示次黄嘌呤。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述DPO-PCR引物对在体系中的浓度为0.1~0.6μmol/L。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述DPO-PCR引物对在体系中的浓度为0.2μmol/L。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，还包括阳性标准品、阴性对照品、PCR预混液和无核酸酶水。

本发明还提供所述的试剂盒在检测花生矮化病毒和/或番茄环斑病毒中的应用。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述检测过程中退火温度为45~65℃。