[发明专利]RNA建库方法

说明书

本申请提供了一种RNA建库方法。该建库方法包括：利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA；对mRNA进行片段化处理，得到片段化mRNA；对片段化mRNA进行逆转录，得到片段化双链cDNA；对片段化双链cDNA进行文库构建，得到降解RNA测序文库。通过利用poly(dT)与ploy(A)结合的方式富集mRNA后，先对富集的mRNA进行片段化处理，然后逆转录合成双链cDNA，之后利用经典的末端修复加A和TA碱基连接方式建库，提高对降解RNA的兼容性，使得该建库方法能够适合任意样本的RNA文库构建。该建库方法对降解RNA文库构建及产出数据质量的提高效果更显著。

技术领域

本申请涉及测序文库构建领域，具体而言，涉及一种RNA建库方法。

背景技术

RNA-seq是研究真核生物转录组基因表达的重要工具，近年来出现的绝对定量RNA-seq 建库方法和试剂盒可通过对逆转录后的cDNA分子加入分子标签(UniqueMolecule identifier, UMI)来校正因PCR扩增产生的偏好性，达到准确定量转录组基因表达的效果；同时，也可 纠正测序过程产生的错误碱基。但是，目前的方法和试剂盒对RNA质量要求很高，降解的 RNA样本很难保证测序数据的质量。

比如，武汉康测科技的绝对定量试剂盒，该试剂盒要求RNA的RIN值须达到7，琼脂糖 电泳28S:18S比例要大于1.5，无拖带等。其原理通过逆转录引物(ReverseTranscription,RT) 在逆转录过程引入PCR上游位点；随后，通过单链分子间连接的方式在cDNA第一链引入 UMI和PCR下游位点；最后，通过PCR扩增和纯化完成文库构建。

可见，目前现有的试剂盒并不适用于降解或RIN值较低的RNA样本，产生的测序结果往 往存在重复数据占比高(Dup率高)、有效数据占比低(Clean Reads低)且含有大量的接头污 染等问题，特别是大规模核酸提取过程中，在很难保证获得高纯度、高RIN值RNA的情况下， 上述方法或试剂盒并不适用于产业化测序建库的需求。

申请内容

本申请的主要目的在于提供一种RNA建库方法，以解决现有技术中解决产业化测序建库 中现有方法不适合降解RNA样本建库测序的问题。

为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种RNA建库方法，该建库方法包 括：利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA；对mRNA进行片段化处理，得到片段化 mRNA；对片段化mRNA进行逆转录，得到片段化双链cDNA；对片段化双链cDNA进行文 库构建，得到降解RNA测序文库。

进一步地，采用带poly(dT)的磁珠对总RNA中的mRNA进行捕获富集，得到磁珠-mRNA 复合物；优选地，总RNA为存在降解的总RNA，更优选为RIN值≤7的总RNA。

进一步地，利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA包括：将总RNA样本在第一 温度下(优选为60～68℃，更优选为65℃)变性以打开二级结构；随后，将带poly(dT)的磁珠 与打开二级结构后的总RNA混合，得到混合物；在第二温度(优选为20～27℃，更优选为25℃) 下使得poly(dT)与ploy(A)结合从而对mRNA进行第一次捕获；在第三温度(优选78～85℃， 更优选为80℃)下使磁珠释放第一次捕获的产物；将释放第一次捕获的产物之后的磁珠进行 处理(即加入结合缓冲液)后，再次使poly(dT)与ploy(A)结合从而对mRNA进行二次捕获。

进一步地，对mRNA进行片段化处理，得到片段化mRNA包括：将磁珠-mRNA复合物 与片段化缓冲液在90～95℃下孵育打断，得到片段化mRNA；优选地，孵育打断的时间为 10～20min。

进一步地，对片段化双链cDNA进行文库构建，得到降解RNA测序文库包括：对片段化双链cDNA进行末端修复加A，得到修复DNA；对修复DNA连接带分子标记的接头，得 到连接产物；对连接产物进行PCR扩增，得到降解RNA测序文库。