[发明专利]创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme与用途

说明书

本发明公开了一种用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme。该DNAzyme共具有103个碱基和含有两个特殊loop环的二级结构，其对创伤弧菌具有高特异性，检测限可低至10³ CFU/mL,检测范围为2.2×10³ CFU/mL至2.2×10⁸ CFU/mL。本发明还对该DNAzyme进行了碱基突变改造，得到3条具有活性的突变体DNAzymes，并且通过对突变体进行动力学检测发现其切割速率活性提高了。本发明的RNA特异性切割的DNAzyme可被广泛的应用于水产养殖、食品加工检验、环境中的创伤弧菌的快速检测。

技术领域

本发明属病原微生物检测技术领域，具体涉及一种可用于创伤弧菌特异性RNA 切割DNAzyme，本发明还涉及其筛选与用途。

背景技术

创伤弧菌是海水中常见的弧菌致病菌群，革兰氏阴性嗜盐性菌，栖息在世界各地的沿海温暖的水域中无处不在，它是水产品污染的重要病原体，可导致水产养殖疾病。同时创伤弧菌也是人类致命的致病性病原体，可以引起的人类急性胃肠炎和原发性败血症、创伤感染和蜂窝织炎等临床症状，最致命的后果是原发性败血症，在免疫功能低下的人群中死亡率超过50％，即使经过及时诊断和治疗也可能导致24小时内死亡。人类感染创伤弧菌引起疾病的原因通常是由于人类食入生的或未煮熟的软体动物贝类或海产品。若皮肤有伤口的人游泳或接触被该菌污染的水域也可以引起人类的疾病，严重感染者需大面积清创甚至截肢。因此 创伤弧菌又被称为“海洋中的无声杀手”。在美国，每年与海产品相关的死亡事件中95% 是由于人类感染了创伤弧菌，而中国的水产品种类繁多，每年都经常报告由水产品引起的食物中毒，急性胃肠炎或腹泻，因此带来严重的经济和社会负担。牡蛎是创伤弧菌最重要的传染源，创伤弧菌在牡蛎、贝类等海产品中的检出率为13% ～95%，我国内陆地区水产品中创伤弧菌的检出率一般在10%以内，沿海地区的检出率常在20% ～67%之间。在弧菌污染高的地区，海鲜（尤其是牡蛎）的安全性是一个普遍的问题。创伤弧菌感染不仅给水产养殖业造成经济损失，而且还危害人类健康。因此，建立创伤弧菌的快速检测方法非常重要。

DNAzyme是一类人工合成的具有催化作用的功能核酸分子，也是通过体外筛选的方法获得的。最早发现的DNAzyme是由Breaker 和Joyce通过利用金属离子设计的一种体外筛选技术得到，该DNAzyme在铅离子存在下催化酯交换反应，这同时也表明单链的DNA确实可以作为类似核酶和蛋白质酶的催化剂。此后，很多的DNAzyme被分离出来用于催化各类生物反应如：RNA的切割反应，DNA的切割反应，磷酸化反应。然而RNA切割活性的DNAzyme得到最广泛的应用，因为它们通常尺寸小，易分离且反应快速，它是将单个RNA嵌入到DNA的序列当中并保持最佳的特性。一般而言，这类DNAzyme通常由底物链和酶链组成，底物链修饰有单个RNA(rA)的连接点并且作为切割位点，酶链则是包含催化核心部分及两臂。酶链可以有不同主要和次要结构，独特的辅因子，pH值的依赖性和特殊的底物链。在含有催化反应的辅因子时，酶链催化切割底物链，使其断裂为两部分。辅因子包括金属离子和氨基酸，可以由此设计出基于不同辅因子的生物传感器。此外，DNAzyme对底物链表现出很高的特异性，高敏感性和高选择性识别，这些优良的性能激励人们不断的研究和发现新型的DNAzyme并将其应用于临床医药研究，希望能通过对编辑癌蛋白的RNA精准识别并定向切割来实现肿瘤、癌症等疾病的发生。目前，DNAzyme主要应用于金属离子检测、生物传感、医药研究及纳米材料研究等领域。

目前国内外对创伤弧菌的研究主要体现在其溶血素、MARTX毒素、铁载体、荚膜多糖、脂多糖以及金属蛋白酶等方面的研究。国内外对创伤弧菌的检测方法有很多，例如：间接荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫层析试纸条、环介导等温扩增技术、聚合酶链反应(PCR)检测等，但大都存在检测时间较长、过程复杂、成本高等问题，不能广泛的应用于基层养殖渔场。目前，DNAzyme的筛选主要集中在金属离子、微生物细胞、蛋白质以及小分子等方面。尽管已有大量的和细菌相关的DNAzyme被研究报道，但将创伤弧菌与DNAzyme切割原理相结合的应用研究尚未见报道。

发明内容