[发明专利]一种指示pH值的荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种可通过颜色指示pH值的荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针的化学结构式为：可通过2‑吗啉乙磺酸与2‑苯并噻唑乙酸合成得到反应产物N‑（2‑苯并噻唑）苯基‑2‑吗啉代乙烷磺酸胺，再进一步用二氯甲烷萃取，最终得到产物。本发明的荧光探针合成路径简单，在一定激发波长照射下，可通过肉眼观察到颜色变化，进而达到检测pH值的目的。本发明提供荧光探针的合成方法。

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种指示pH值的荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

pH值的变化与许多生物反应的进行息息相关，而核酸检测技术作为分子生物学中的一项重要技术也与pH值的变化密切相关，其中环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）因具有较高的灵敏度和较快的反应速率，备受研究者的青睐。环介导等温扩增在反应过程中进行大量的DNA复制，消耗大量的脱氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs），当dNTPs被消耗后会产生大量的焦磷酸根离子，这些焦磷酸根离子会导致整个反应体系中的pH值降低。因此，可以通过观察pH值的变化来判断是否含有目标核酸进行扩增反应。

常见的pH值检测方法有玻璃电极法，但其存在电化学干扰、尺寸大等缺陷，pH试纸检测方法只适用于粗略测量，均不适合用于微量检测，更不能达到核酸检测的目的；可用于检测细胞内而pH值的方法包括³¹P核磁共振法，吸收光谱法等，但这些方法存在机械损伤，价格昂贵等缺点。虽然以上传统的方法可用于pH值的检测，但这些方法通常需要样品预处理和破坏细胞，操作复杂，在生物学研究中受到限制。基于荧光的pH检测方法响应快，在pH值由4变为9的过程中可实现由红光变黄绿光的变化，从而实现pH值的检测。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种检测pH的荧光探针，可通过荧光的变化实现对pH值4—9范围内的检测。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种指示pH值的荧光探针，该荧光探针的化学结构式1所示：

式 1 化学结构式

上述指示pH值的荧光探针的制备方法，通过以下步骤：

（1）将2-（N-吗啉代）乙烷磺酸（化合物1）加入至无水二氯甲烷溶液/三氯甲烷/氯仿/二氯乙烷中、再滴加草酰氯和二甲基甲酰胺，在氮气保护下，放入冰水浴中充分搅拌，反应完全后，过滤除去滤渣并浓缩滤液，可得化合物2。

（2）取靛红酸酐、冰醋酸和2-氨基苯硫酚在45 ℃水浴环境下反应。待反应结束后，冷却至室温，倒入纯水中，析出黄褐色沉淀，使用氢氧化钠溶液调节体系的pH值近中性后，有大量黄褐色沉淀析出。减压过滤得到固体沉淀，并用饱和氯化钠溶液洗涤3次。将收集到的滤饼置于50 ℃烘箱中干燥。然后柱层析分离纯化得到黄褐色产物，即化合物3。

（3）取化合物3溶解在无水二氯甲烷/三氯甲烷/氯仿/二氯乙烷中，加入一定量三乙胺溶液。将混合物冷却至0 ℃，逐滴添加化合物2在无水二氯甲烷中，室温下搅拌反应至完全。纯水淬灭反应、收集有机层、干燥后减压旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后可得化合物4。

（4）取化合物4溶于乙酸酐中，50 ℃下缓慢滴加硝酸和冰醋酸并搅拌反应。反应完成后，使用NaOH溶液中和过量的酸。采用二氯甲烷萃取所得混合物，有机层采用无水硫酸镁干燥，减压除去残留的溶剂，得到浅黄色固体状的粗硝基化合物。最后将粗产物溶解在四氢呋喃中，并加入10 ％Pd/C粉末，在室温下搅拌一段时间。过滤后，减压除去溶剂得到最终产物ABT-Lys。

本发明的另一目的是提供一种上述指示pH值的荧光探针在核酸检测中的应用。

本发明的机理如下：