[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术检测增强子核心元件的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)设计增强子的靶位点gRNA并插入CRISPR/Cas9质粒中，得到CRISPR/Cas9重组载体；所述增强子的靶位点gRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的gRNA；

2)设计并制备增强子的供体ssDNA，所述增强子的供体ssDNA的设计方法包括以下内容：

B1.以Cas9蛋白在基因组中的切割位点为中心，截取上游90bp和下游90bp分别作为ssDNA的左右同源臂，其中下游的90bp序列删除了增强子核心元件序列并在基因组上向3'端延伸了增强子序列长度以补齐下游的90bp序列；

B2.将gRNA识别位点进行突变设计，引入基因组中该区域不存在的内切酶位点；

B3.将PAM序列的NGG突变为NCG；

3)用CRISPR/Cas9重组载体和供体ssDNA共同转染细胞，得到转染细胞；

所述供体ssDNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的供体ssDNA；

4)对所述转染细胞检测，敲除增强子的细胞的增殖速率高于野生型细胞；

步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。

2.根据权利要求1所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术检测增强子核心元件的方法，其特征在于，步骤1)中载体中启动子为U6启动子，设计的增强子的靶位点gRNA的5'端以G开始。

3.根据权利要求1所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术检测增强子核心元件的方法，其特征在于，靶位点gRNA插入CRISPR/Cas9质粒的多克隆位点为Bbs I酶切位点；

所述CRISPR/Cas9质粒为px458。

4.根据权利要求1所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术检测增强子核心元件的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9重组载体和供体ssDNA的质量比为3:2；

细胞的转染体系为250μL Opti-MEM培养基、7.5μL Lipofectmine 3000试剂、1.5μg质粒DNA、1μg ssDNA和5μL P3000试剂。

5.根据权利要求1～4任意一项所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术检测增强子核心元件的方法，其特征在于，所述检测包括所述转染细胞中增强子的检测、所述转染细胞的细胞增殖活性和靶基因表达情况的检测。

6.根据权利要求5所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术检测增强子核心元件的方法，其特征在于，所述转染细胞中增强子的检测采用普通PCR扩增的方法进行检测；

普通PCR扩增的反应体系为95℃，5min预变性；95℃，1min，65℃，30sec，72℃，1min，30个循环，每个循环退火温度递降0.8℃，延伸时间1kb/30s；

普通PCR扩增用引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO:11/SEQID NO:12所示的引物对。

7.根据权利要求5所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术检测增强子核心元件的方法，其特征在于，所述靶基因表达情况检测包括以ACTB基因为内参基因，采用RT-qPCR方法检测靶基因；

所述转染细胞的细胞增殖活性的检测包括CCK8细胞增殖活性检测和EdU细胞增殖活性检测。