[发明专利]一种反相色谱纯化制备利拉鲁肽的方法

说明书

本发明公开一种高效的利拉鲁肽的纯化分离方法，涉及一种色谱技术纯化利拉鲁肽的改进方法。本方法采用高效液相反相制备色谱技术对利拉鲁肽进行分离纯化，该制备方法以反相色谱填料为基质，对纯化工艺条件中重要参数进行优化，如缓冲盐种类、浓度、pH、流动相梯度及上样量等，使样品具有适当的保留和良好的峰形；采用优化后的纯化工艺可以获得高纯度利拉鲁肽。本发明方法具有高选择性、载样量大、收率高等优势，本发明所要解决的技术问题是现有制备方法分离纯化困难、产品的总收率和纯度低。本发明为缩短生产周期、降低生产成本、提高产品质量提供了一种新的方法。

技术领域

本发明属于色谱技术纯化分离多肽的制备领域。具体涉及一种色谱技术纯化制备利拉鲁肽的方法。

背景技术

利拉鲁肽为人胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide1，GLP-1)类似物，GLP-1是由前激素转换酶(PC1)在肠黏膜的L细胞内将胰高血糖素原(proglucagon)剪切为其羧基端的肽链序列。GLP-1有2种生物活性形式，一种是GLP-1(7-37)，另一种是GLP-1(7-36)酰胺。两者仅有一个氨基酸序列不同，GLP-1约80％的循环活性来自GLP-1(7-36)酰胺。GLP-1作用靠受体介导，可结合并激活GLP-1受体。

利拉鲁肽与GLP-1(7-37)有97％同源性，它是将GLP-1(7-37)的Lys34替换成Arg34，Lys26侧链上连接一条16碳棕榈脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))，并切除多余氨基酸而获得。其在体内通过酰基化与白蛋白结合，自联形成稳定的七聚体，从皮下组织缓慢降解，不易被二肽基肽酶-4(DPP-4)降解，减少肾脏滤过作用，血浆半衰期长达13h，降糖作用大于24h。临床结果显示利拉鲁肽具有显著降低2型糖尿病患者的HbAlc水平、体重及改善β细胞功能。美国糖尿病学会(ADA)和欧洲糖尿病研究协会(EASD)在2009年出版的共识中建议，选用GLP1类似物减重和避免低血糖风险，将HbA1c降至小于8％时使用。英国国家健康与临床优化研究所(NICE)建议，对于肥胖患者(BMI＞25kg/m^-2)可以将GLP1类似物作为替代胰岛素使用。

目前市售的利拉鲁肽是由丹麦诺和诺德公司研制的，2010年被FDA批准上市，利用酿酒酵母以胞外分泌方式表达Arg34GLP-1(7-37)(如WO98/008871)。国内也有多家公司利用重组表达利拉鲁肽并进入临床阶段。通过诺和诺德公开文献可知利拉鲁肽制备需从发酵表达开始，经过澄清、捕获、沉淀以及多步纯化得到较纯的前体，酰化后通过阴离子交换层析及反相高效液相色谱等纯化制备终产品。如CN200480024090.2利用阴离子交换色谱纯化去除酰化后外消旋化氨基酸杂质，如CN200480024089.X利用RP-HPLC去除酰化后利拉鲁肽相关杂质。

现公开及生产上使用的纯化利拉鲁肽的方法也存在步骤较多、收率低及纯度不高的问题，同时使用的高效液相反相色谱现工艺的成本高。马艳池等以固相合成得Arg34GLP-1(7-37)，经由谷氨酸介导的肽链棕榈酰化，制备获得利拉鲁肽，经RP-HPLC纯化得到纯度为96.77％的样品，而总收率较低，约12.8％。CN102584982A专利将固相合成的利拉鲁肽溶于乙腈水溶液获得粗肽溶液后，通过4步HPLC纯化获得利拉鲁肽，得到纯度为98.4％的活性药物，总收率约61.3％。CN103275208A专利通过改变固相合成的原料，避免相关杂质产生，经RP-HPLC纯化后获得的样品纯度约98.6％，最大单一杂质控制在0.3％以下，总收率约20.2％。目前利拉鲁肽的工艺生产中产生的杂质的性质与其相似，故纯化制备高纯度利拉鲁肽成品的难度较大；针对利拉鲁肽现有纯化制备方法存在难题，急需寻找一种高效率的利拉鲁肽分离纯化且适合工业化的生产工艺。

本发明通过对利拉鲁肽的反相色谱纯化分离的工艺条件进行优化摸索及峰展宽比较后得到最适的纯化制备参数，应用该纯化工艺条件方法可以高效的制备高纯度的利拉鲁肽样品。本发明的方法适用于液相分析色谱、半制备色谱、特别是液相制备色谱，可以广泛的应用于利拉鲁肽的工业化放大制备。

发明内容