[发明专利]一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法

说明书

本发明公开了一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法，包括克隆的草甘膦主要靶点EPSP合酶作为草甘膦的受体蛋白；将受体蛋白与绿色荧光蛋白进行融合，构建了EPSPS‑GFP这一既含有草甘膦结合部位，又带有荧光标记的新蛋白，在大肠杆菌中原核表达纯化，将其用于水中的草甘膦检测。本发明通过构建融合蛋白采用荧光光度计检测荧光响应值的变化，建立标准校正曲线，实现对草甘膦除草剂的定性定量检测。

技术领域

本发明涉及草甘膦检测提取领域，具体地说，是涉及一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法。

背景技术

草甘膦，英文名称glyphosate，化学名称为N-磷酸甲基甘氨酸，是一种内吸传导型广谱灭生性除草剂，其作用机理主要是抑制植物体内的烯醇丙酮基莽草酸磷酸合成酶(EPSP合酶)，从而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化，使蛋白质合成受到干扰，导致植物死亡。草甘膦是世界上应用最广、产量最大的农药品种，年销售量高居农药之首。世界各国对饮用水中草甘膦的最大残留限量(MRL)均制定了限量规定，美国环境保护协会(EPA)制定饮用水中草甘膦的MRL为700μg/L；加拿大规定饮水中草甘膦最大可接受限量(MAC)为280μg/L；我国在《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)规定了饮用水中草甘膦限量为700μg/L。

由于草甘膦极性较大，难溶于有机溶剂，缺乏可用于检测的官能团，采用液相、气相等色谱方法检测均需要衍生化；离子色谱干扰因素较多，对检测结果影响严重；ELISA和胶体金检测等免疫分析方法受抗体所限，稳定性和灵敏度不高。因此，研发操作简便、成本低、灵敏度高、特异性好的草甘膦快速检测方法尤为重要。因此需要一种能有效解决上述问题的一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明包括以下步骤：

A克隆的草甘膦主要靶点EPSP合酶作为草甘膦的受体蛋白；

B将受体蛋白与绿色荧光蛋白进行融合得到融合蛋白；

C将所述融合蛋白在大肠杆菌中原核表达纯化，将其用于水中的草甘膦检测。

进一步地，所述受体蛋白与绿色荧光蛋白进行融合的融合方法包括：

a从烟草中克隆烯醇丙酮基莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)基因，测序后合成基因的cDNA序列，采用同源重组法连入可表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的原核表达载体pET-28a-eGFP中，使EPSPS与eGFP形成融合蛋白，得到新的重组表达载体。

b采用热激转化法将该质粒载体导入大肠杆菌表达菌株BL21中，37℃摇床上180rpm摇菌2h后，加入IPTG诱导表达，摇床上继续摇菌培养16h。

C 12000r离心2min，弃去上清，收集菌体，用PBS(50mM，pH7.5)缓冲液重悬后，采用工作2s，间歇8s，总时间30min条件下超声波破菌，离心取上清，收集粗蛋白。

进一步地，所述原核表达纯化的条件为：

a利用融合蛋白上带有的His标签，采用Ni柱进行亲和层析，获得纯化后的融合蛋白。