[发明专利]一种增加应激性海藻糖含量的耐热性黑曲霉工程菌的构建方法

说明书

本发明公开了一种增加应激性海藻糖含量的耐热性黑曲霉工程菌的构建方法，属于基因工程技术领域。本发明公开的耐热性黑曲霉工程菌的构建方法如下：首先构建异源表达tpsA和tpsB基因的重组质粒，tpsA和tpsB基因序列片段由cox启动子以及TtrpC终止子控制；同时利用同源重组技术敲除海藻糖降解基因ATH1，从而获得高耐热性的黑曲霉工程菌。本发明经过实验证实，与野生型菌株相比，该黑曲霉基因工程菌株内应激性海藻糖含量显著升高，43℃条件下工程菌可正常生长和产酶，葡萄糖酸产量未见降低，为高温条件下利用微生物发酵制备葡萄糖酸钠提供了优良菌种。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种增加应激性海藻糖含量的耐热性黑曲霉工程菌的构建方法。

背景技术

海藻糖广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、昆虫及无脊椎动物中，既是一种贮藏性糖类，又是应激代谢的重要产物。由于海藻糖是由特殊双糖分子构成的非还原性糖，性质非常稳定，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，有效的保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。真核生物中海藻糖合成分为两步：首先在6-磷酸海藻糖合成酶(由TPSA编码)的作用下，由尿苷二磷酸-D-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸合成海藻糖-6-磷酸；然后在海藻糖磷酸合酶(由TPSB编码)的催化下，海藻糖-6-磷酸脱去磷酸生成海藻糖。

当对数生长期的细胞面临高温、氯化钠、过氧化氢、硫酸铜、高浓度酒精(体积分数7％)、弱有机酸等胁迫时，细胞内海藻糖浓度会有不同程度的上升。Hottiger等认为海藻糖参与热耐受的机制是：(1)增加热环境下蛋白的稳定性；(2)抑制热应激所致的蛋白凝集。Singer等通过研究酵母细胞提出，适当的海藻糖含量可维持变性蛋白的半折叠状态，有利于分子伴侣的进一步加工。这些研究表明海藻糖在提高细胞热耐受性方面具有重要意义。

葡萄糖酸钠是一种多羟基有机酸盐，在化工、食品、医药、轻工等行业有广泛的用途。目前葡萄糖酸钠的生产多采用黑曲霉发酵法，并且建立了先进的发酵设备和完善的工艺控制流程，企业的生产能力主要受制于生产菌种的活力及性能。目前葡萄糖酸钠发酵生产利用最好的菌株是黑曲霉，但菌株耐高温性能差是相关企业普遍面临的难题。黑曲霉生长的最适温度一般在33℃-37℃，当发酵罐温度超过40℃时，菌株生长和产酶速率显著下降。每当夏季生产车间温度最高可达40℃以上，为保证正常生产必需消耗大量的冷却水给发酵罐降温，由此消耗大量能量。基于此，构建高耐热性产葡萄糖酸钠的黑曲霉工程菌的任务迫在眉睫。

因此，提供一种增加应激性海藻糖含量的耐热性黑曲霉工程菌的构建方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种增加应激性海藻糖含量的耐热性黑曲霉工程菌的构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种增加应激性海藻糖含量的耐热性黑曲霉工程菌的构建方法，具体步骤如下：

(1)以黑曲霉FG-2基因组为模板，PCR扩增cox启动子序列；以pAN7-1质粒为模板，PCR扩增TtrpC终止子序列；采用多片段的一步克隆试剂盒将上述2段基因片段和线性化的pAN7-1载体进行连接，获得重组载体pAN7-1-cox-TtrpC；所述cox启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述TtrpC终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)根据黑曲霉密码子偏好性设计的柔性肽W1、W2和W3序列，刚性肽P1、P2和P3序列作为基因tpsA和tpsB的linker；以黑曲霉FG-2基因组为模板，分别PCR扩增tpsA和tpsB基因片段；采用重叠PCR的方式获得不同的tpsA-linker-tpsB基因片段；