[发明专利]一种低温冷冻的脐带血单个核细胞的复苏方法有效

专利信息
申请号: 202011412733.8 申请日: 2020-12-04
公开(公告)号: CN112501117B 公开(公告)日: 2021-09-07
发明(设计)人: 储王龙;刘沐芸;梁晓;苏华莹;胡隽源;朱丽萍;王嘉楠;张芬;钟振忠;王清芳 申请(专利权)人: 深圳市北科生物科技有限公司;河北北科生物科技有限公司
主分类号: C12N5/078 分类号: C12N5/078
代理公司: 深圳市精英专利事务所 44242 代理人: 蒋学超
地址: 518000 广东省深圳市南*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 一种 低温 冷冻 脐带血 单个 细胞 复苏 方法
【说明书】:

发明提供了一种低温冷冻的脐带血单个核细胞的复苏方法,包括:将复苏洗涤液放置在37℃的环境中;将低温冻存的脐带血单个核细胞置于37℃水浴锅中进行复温;将复温完成的脐带血单个核细胞转移至离心管;将复苏洗涤液分为第一复苏洗涤液和第二复苏洗涤液,其中第一复苏洗涤液与第二复苏洗涤液的容量比值为0.154‑0.25;将第一复苏洗涤液匀速滴加到离心管中,滴加时间为160‑170秒;将第二复苏洗涤液匀速滴加到离心管中,滴加时间为50‑60秒,获得细胞悬液;通过离心法将细胞悬液分层;去除上清液。本发明的有益效果在于:通过优化细胞复苏的操作方法,在不改变冻存液和洗涤液配方的情况下,有效提高了复苏细胞活率及回收率,大大改善了复苏效果。

技术领域

本发明涉及细胞复苏技术领域,尤其是指一种低温冷冻的脐带血单个核细胞的复苏方法。

背景技术

脐带血单个核细胞是一种从脐带血中分离出来的具有单个核的细胞,区别于无细胞核的红细胞,主要是由单核细胞和淋巴细胞组成。分离方法主要有Ficoll(聚蔗糖—泛影葡胺)密度梯度离心法及HES(羟乙基淀粉)沉降法。

分离后的脐带血单个核细胞中富含CD34+造血组细胞(EPCs)及CD14+单核细胞,可以释放出多种细胞因子,发挥神经保护、血管生成和免疫调节的作用,可以很好的用于神经系统疾病的治疗,例如新生儿缺氧缺血性脑病、中风等。同时,脐带血单个核细胞中也富含T细胞、NK细胞,可以用于扩增CIK、CAR-T、CAR-NK等免疫细胞,用于肿瘤免疫治疗。

现有的复苏方法需要将细胞冻存管置于37℃水浴锅中,在快速复温后将细胞迅速转入4℃预冷的洗涤液中。然后进行离心,并去除离心后的上清液,以降低DMSO对细胞产生的损伤和降低回输后对人体的副作用。

由于刚复苏脐带血单个核细胞较脆弱,耐受性较差。一方面,复苏后的细胞快速加入4℃预冷的洗涤液中,细胞会经历较大的渗透压变化,从而容易发生破裂;另一方面,加入4℃预冷的洗涤液后再进行离心,外部施加的离心力将会导致脆弱的细胞发生破裂。

采用现有复苏方法复苏单个核细胞,复苏后的细胞活率和活细胞的回收率都偏低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是:针对现有技术的不足,提供一种低温冷冻的脐带血单个核细胞的复苏操作方法,能够显著提高低温冷冻的脐带血单个核细胞的活率和回收率。

为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:一种低温冷冻的脐带血单个核细胞的复苏方法,包括:

S1、将复苏洗涤液放置在37℃的环境中;

S2、将低温冻存的脐带血单个核细胞置于37℃水浴锅中进行复温;

S3、将复温完成的脐带血单个核细胞转移至离心管;

S4、将复苏洗涤液分为第一复苏洗涤液和第二复苏洗涤液,其中第一复苏洗涤液与第二复苏洗涤液的容量比值为0.154-0.25;

S5、将第一复苏洗涤液匀速滴加到离心管中,滴加时间为160-170秒;

S6、将第二复苏洗涤液匀速滴加到离心管中,滴加时间为50-60秒,获得细胞悬液;

S7、通过离心法将细胞悬液分层;

S8、去除上清液。

进一步的,所述复苏洗涤液为0.9%氯化钠注射液。

进一步的,所述复苏洗涤液为5%人血白蛋白与10%右旋糖酐-40按1:1比例混合的溶液。

进一步的,在步骤S1之中,将复苏洗涤液放置在37℃的环境中至少6小时。

进一步的,在步骤S2之中,将低温冻存的脐带血单个核细胞置于37℃水浴锅中进行复温的复温时间为2-3分钟。

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