[发明专利]一种基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒及提取方法

说明书

本发明公开了一种尿液游离DNA提取试剂盒及其提取方法，用于尿液中游离DNA的提取；尿液游离DNA提取试剂盒包括优化的裂解结合液、二氧化硅磁珠和清洗液、洗脱液；本发明中的裂解结合液添加十二烷基磺酸钠作为裂解增强剂以提高游离DNA的提取量；二氧化硅磁珠为经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠，浓度为10‑100mg/mL；本发明涉及的尿液游离核酸提取试剂盒包括具有高回收效率，操作方法简单，耗时短，并能够高通量自动化操作，提取方法简便易行。

技术领域

本发明涉及核酸提取纯化技术领域，具体涉及一种基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒及提取方法。

背景技术

循环游离核酸cfDNA，是指存在于人体的游离于细胞外的微量内源性或外源性核酸片段，包括游离DNA、游离RNA和线粒体DNA等。cfDNA片段主要是来自于坏死的肿瘤细胞核凋亡的正常细胞、胎盘、组织等，cfDNA水平异常可以作为恶性肿瘤和妊娠相关性疾病和自身免疫病等越来越多的疾病诊断、治疗检测和预后评估的根据。

最近液态活检技术受到越来越多的关注，液态活检是以血液、尿液、唾液等体液为检测载体的一类非侵入性的检测方法。其原理为通过检测肿瘤细胞坏死释放到体液的物质，从而达到检测肿瘤的目的。而二代测序技术(next generation sequencing，NGS)以及数字PCR(Droplet digital PCR，dd PCR)技术的出现，使得在大量非肿瘤DNA中找到微量的肿瘤DNA(Tumour DNA，tDNA)成为可能。因此也为液态活检从尿液检测DNA提供了相应的可能性。

游离DNA的提取成为检测的关键步骤，传统使用的试剂沉淀法需要用到酚，氯仿，乙醇等存在一定的毒性的试剂，尤其是酚、氯仿具有致癌的潜在风险，且实验过程中需要配置的试剂量多，降低核酸提取效率。而采用离心柱方法的缺陷在于处理的样本体积收到离心柱的体积限制，离心操作费时，没办法进行高通量提取。

因此，亟待一种具有高回收效率，操作方法简单，耗时短，并能够高通量自动化操作的尿液游离核酸提取试剂盒及其提取方法的出现，用于尿液中游离核酸的提取。

试剂盒提取游离DNA的步骤主要为样本裂解、磁珠结合、磁珠洗涤、磁珠干燥、洗脱。其中，样本裂解效率对最终的游离DNA提取量影响很大，裂解不充分会导致后面所有步骤提取的游离DNA回收率明显降低，所以裂解效果的增强是至关重要的。本发明研究了一种优化后的裂解液配方并添加一种阴离子表面活性剂作为裂解增强剂以提高游离DNA的提取量。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提出了一种具有高回收效率，操作方法简单，耗时短，并能够高通量自动化操作的尿液游离核酸提取试剂盒及其提取方法，用于尿液中游离核酸的提取。

本发明的技术方案如下：

一方面，本发明公开了一种基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，所述尿液游离DNA提取试剂盒包括优化的裂解结合液、二氧化硅磁珠和清洗液、洗脱液；裂解结合液添加裂解增强剂提高裂解效果；

所述二氧化硅磁珠为经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠，浓度为10-100mg/mL；

所述裂解结合液包括以下组分：

1-20mg/mL蛋白酶K；

1.1～15M离液盐；

0.1-0.5M苯甲酸钠；

5％Triton X-100；

0.1-1％十二烷基磺酸钠；

0.1-10M氯化钠；

1-20％聚乙烯醇PEG 2000；

0.1-10％月桂基硫酸钠缓冲液；

0.1-5％柠檬酸钠；