[发明专利]工程化的Cas效应蛋白及其使用方法

权利要求书

1.工程化的Cas核酸酶，其在柔性区包含一个或多个突变，其中所述工程化的Cas核酸酶与所述参比Cas核酸酶相比具有提高的活性；其中，所述参比Cas核酸酶为Cas12i，该参比Cas核酸酶的氨基酸残基序列如SEQ ID NO: 8所示，所述柔性区为氨基酸残基439-443和/或氨基酸残基925-929；所述工程化的Cas核酸酶的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO: 14、18、20。

2.如权利要求1中所述的工程化的Cas核酸酶，其中所述柔性区为氨基酸残基439-443。

3.如权利要求1中所述的工程化的Cas核酸酶，其中所述柔性区为氨基酸残基925-929。

4.如权利要求1中所述的工程化的Cas核酸酶，包含在两个柔性区的突变，其中所述两个柔性区为氨基酸残基439-443和氨基酸残基925-929。

5.如权利要求1所述的工程化的Cas核酸酶，其中所述活性是位点特异性核酸酶活性。

6.如权利要求5的工程化的Cas核酸酶，其中所述工程化的Cas核酸酶在真核细胞中一个或多个基因组位点的基因编辑效率比所述参比Cas核酸酶高至少20%。

7.如权利要求6所述的工程化的Cas核酸酶，其中所述基因编辑效率使用如下方法来测量：T7核酸内切酶1 (T7E1)测定、靶DNA的测序、由分解追踪插入缺失(TIDE)测定或通过扩增子分析进行插入缺失检测(IDAA)测定。

8.一种工程化的Cas效应蛋白，其包含权利要求1-7中任一项所述的工程化的Cas核酸酶。

9.如权利要求8所述的工程化的Cas效应蛋白，其中所述效应蛋白能够诱导DNA分子中的双链断裂或单链断裂。

10.如权利要求8所述的工程化的Cas效应蛋白，其还包含与所述工程化的Cas核酸酶融合的功能结构域。

11.如权利要求10所述的工程化的Cas效应蛋白，其中所述功能结构域选自下组：翻译起始结构域、转录阻遏结构域、反式激活结构域、表观遗传修饰结构域、核碱基编辑结构域、逆转录酶结构域、报告分子结构域和核酸酶结构域。

12.如权利要求8所述的工程化的Cas效应蛋白，其包含第一多肽和第二多肽， 第一多肽包含权利要求1-7中任一项所述的工程化的Cas核酸酶的N末端部分氨基酸残基1至X，第二多肽包含权利要求1-7中任一项所述的工程化的Cas核酸酶的氨基酸残基X+1至所述Cas核酸酶的C末端 ，其中所述第一多肽和所述第二多肽能够在包含指导序列的指导RNA的存在下彼此缔合，以形成与靶核酸特异性结合的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)复合物，所述靶核酸包含与所述指导序列互补的靶序列。

13.一种工程化的CRISPR-Cas系统，包括：

(a)权利要求8-12中任一项所述的工程化的Cas效应蛋白；以及

(b)包含与靶序列互补的指导序列的指导RNA，或编码所述指导RNA的一种或多种核酸，

其中所述工程化的Cas效应蛋白和所述指导RNA能够形成CRISPR复合物，所述CRISPR复合物特异性结合包含所述靶序列的靶核酸并诱导所述靶核酸的修饰。

14.检测样品中靶核酸的方法，包括：

(a)使样品与权利要求13中的工程化的CRISPR-Cas系统以及加标签的检测核酸接触，该检测核酸为单链且不与所述指导RNA的指导序列杂交；以及

(b)测量通过所述工程化的Cas效应蛋白切割所述加标签的检测核酸而产生的可检测信号，从而检测所述靶核酸。