[发明专利]一种通过DNA合成改组组合突变获得的ω-转氨酶突变体及应用

说明书

本发明公开了一种通过DNA合成改组组合突变获得的ω‑转氨酶突变体，由来自土曲霉(Aspergillus terreus)的野生型ω‑转氨酶进行点突变而得，野生型ω‑转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述ω‑转氨酶突变体的突变位点为以下任意一种：(1)F115L‑H210N‑M150C‑M280C；(2)F115L‑H210N；(3)F115L‑H210N‑E253A‑I295V；(4)I77L‑F115L‑E133A‑H210N‑N245D；(5)I77L‑Q97E‑F115L‑L118T‑E253A‑G292D；(6)I77L‑E133A‑N245D‑G292D；(7)H210N‑N245D‑E253A‑G292D。本发明通过DNA合成改组组合突变方法，将前期所得到的正向突变随机组合，通过实验验证，该方法可有效地提高正突变概率，提高实验效率及可行性，并筛选得到热力学稳定性明显优于野生酶的突变酶。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种通过DNA合成改组组合突变获得的ω-转氨酶突变体及应用。

背景技术

手性胺是很多重要药物合成的关键中间体或者手性砌块。目前，这些重要的手性胺化合物的生产方式主要为化学合成法，且一般需要昂贵的钌、铑等过渡金属配合物催化剂或高压等极端反应条件，同时存在选择性差、收率低、排放多等先天不足。因此，能否通过不对称生物催化的方法实现手性胺的工业化生产已成为目前研究者普遍关注的焦点。利用酶催化不对称合成手性胺类化合物主要应用两种酶，一种是氨基脱氢酶，一种是ω-转氨酶。利用氨基脱氢酶前提是要有与之相适应的辅酶再生体系。而ω-转氨酶依赖辅酶磷酸吡哆醛(PLP)可逆地催化氨基转移到前手性酮制备手性胺类化合物，因其高立体选择性和温和的反应条件，成为制备光学纯手性胺的重要生物催化剂。

ω-转氨酶催化过程是由两步半转胺反应组成，遵循双底物乒乓机制，如图1所示，在第一个半反应中，氨基供体底物和辅酶形成一个席夫碱(醛亚胺)，醛亚胺经过进一步质子得失以及将氨基转移给辅酶，结果就得到酮酸和酶结合的5’-磷酸吡哆胺(PMP)。在第二个半反应中，氨基由PMP转移到受体上，得到PLP并且产生了手性胺。

来自于土曲霉(Aspergillus terreus)的ω-转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺。研究表明，该酶野生型在40℃下的半衰期仅为6.9min，其热稳定性有待进一步提高。如CN105441404A、CN105950581A公开了利用定点突变技术对ω-转氨酶野生型进行改造，获得热稳定性进一步提高的ω-转氨酶突变体，使其更适合工业应用。

目前，酶的定向进化技术是一种不需事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，并定向选择或筛选出所需性能更加优良的酶或创造出自然界所没有且优良性质的新酶的方法。近年来，随着定向进化技术的建立与发展，通过它提高酶稳定性的研究越来越多。主要包括非理性设计，理性设计和半理性设计三大块。随着相关研究的深入，利用半理性设计策略对转氨酶进行分子改造的研究备受关注。

本发明申请人一直致力于转氨酶催化合成手性胺方面的工作。通过半理性设计方法对转氨酶进行改造，主要包括添加二硫键(基于结构的半理性设计)，序列一致性(基于序列的半理性设计)以及构建共进化网络来改造转氨酶的热稳定性并获得了一定的提升。但提高转氨酶热稳定性的各种手段均具有各自的优点和缺点，虽然上述实验获得的突变体与野生型ω-转氨酶相比能够提高半失活温度以及延长半衰期，但是若要在实际生产中更好地加以应用，上述突变体的半失活温度和半衰期仍有待进一步提高。

发明内容

本发明基于一种DNA合成改组的方法，通过该方法获得酶活、热稳定性进一步提高的土曲霉属(Aspergillus terreus)ω-转氨酶突变体。

本发明通过固体平板筛选结合96孔板筛选，大大提高了筛选效率和筛选数量。